Due metodi diversi per le piante schermo con nematodi galligeni sono descritti. Gli approcci descritti includono high-throughput schermi con nematodi in modo non distruttivo facilitare l'uso di queste piante in programmi di allevamento.
Nematodi galligeni (Meloidogyne genere) sono parassiti obbligati delle piante. Sono estremamente polifago e considerato uno dei nematodi parassiti economicamente più importanti. Il microscopico seconda fase giovanile (J2), una volta mutate nell'uovo, è la fase infettiva. I J2S schiudono dalle uova, muoversi liberamente nel terreno all'interno di una pellicola d'acqua, e individuare punte delle radici delle specie di piante adatte. Dopo aver oltrepassato la radice, la loro migrazione verso il cilindro vascolare, dove creare un sito di alimentazione e avviare l'alimentazione usando i loro stiletti. Il sito di alimentazione multicellulare è formato da diverse cellule ingrandite multinucleari chiamate 'cellule giganti', che sono formate da cellule che sottoposti a cariocinesi (ripetuto mitosi) senza citochinesi. Le cellule si dividono e si pericycle vicini allargare dimensioni dando origine ad una fiele tipico o nodo radice, il sintomo caratteristico di root-nodo infezione nematode. Una volta che l'alimentazione è iniziato, J2S diventano sedentari e delle Nazioni Unitedergo tre mute supplementari per diventare adulti. La femmina adulta depone 150-250 uova in una matrice gelatinosa sopra o sotto la superficie della radice. Dalle uova si schiudono nuovi J2S infettive e iniziare un nuovo ciclo. La radice-nodo ciclo di vita del nematode si completa in 4-6 settimane a 26-28 ° C.
Qui vi presentiamo il protocollo tradizionale per infettare piante, coltivate in vaso, con nematodi galligeni e due metodi di analisi high-throughput. Il primo high-throughput metodo viene utilizzato per le piante con semi di piccole dimensioni come pomodoro, mentre il secondo è per le piante con semi grandi come fagioli fagiolo e comune. Semi di grandi dimensioni sostenere la crescita estesa piantina con un minimo supplemento nutrizionale. Il primo test un'elevata utilizza piantine coltivate in sabbia in vassoi, mentre negli impianti secondo saggio sono coltivate in bustine in assenza di terreno. Il sacchetto crescita delle piantine è fatto di un 15,5 x 12,5 centimetri stoppino di carta, piegata in alto per formare un 2-cm profondità trogolo in cui è posto il seme o piantina. Ilstoppino di carta è contenuto all'interno di un sacchetto di plastica trasparente. Questi sacchetti di crescita permettono l'osservazione diretta dei sintomi di infezione, i nematodi irritanti di radici e di massa produzione di uova, sotto la superficie di un sacchetto trasparente. Entrambi i metodi consentono l'utilizzo degli impianti schermati, dopo fenotipo, per attraversare o semi produzione. Un ulteriore vantaggio dell'uso di sacche di crescita è l'ingombro ridotto perché buste vengono memorizzati in plastica cartelle sospese disposti in rack.
Ci sono due passaggi critici per uno schermo nematode successo: la preparazione di un inoculo altamente infettivo e utilizzando gli impianti in fase di sviluppo adeguato. Tasso di schiusa delle uova galligeni nematodi è altamente variabile e spazia tra il 5 – 50%. Quindi, per ottenere livelli ottimali di portello e J2S altamente infettivi, particolare attenzione deve essere posta l'estrazione delle uova da cova e le procedure. Le uova dovrebbero essere esposti alla candeggina per un periodo di tempo minimo e candeggina devono essere risciacquati bene dalla miscela di root. Quando cova le uova, l'impasto che contiene le uova non devono essere immerso in acqua. Inoltre, evitare di versare le uova nel piatto sottostante Petri dove sono raccolti i giovani nati. Un modo per evitare di versare le uova durante il processo di cova, non è quello di aggiungere l'acqua direttamente al Kimwipe della carta potrebbe rompersi. Invece aggiungere l'acqua direttamente alla piastra di Petri.
Per ottenere i migliori risultati, utilizzare J2S appena nati. Se il hatch tasso è basso e più inoculo è necessario, J2S può essere conservato a 15 ° C per un periodo più lungo. Scaldare l'inoculo conservato a temperatura ambiente per rivivere i nematodi prima inoculazione. Tuttavia, non conservare i J2S per periodi prolungati anche a 15 ° C come J2S affamati non in grado di infettare in modo efficiente.
Piantine giovani sono il miglior stadio di sviluppo per l'utente root-knot inoculazione nematode. Tuttavia, questo deve essere equilibrata con la formazione di un apparato radicale adeguato fornire un numero sufficiente di apici radicali come punti di entrata per i J2S. Il mantenimento di ottimali condizioni di crescita delle piante è essenziale anche per gli schermi. Evitare di venire l'acquolina in impianti appositamente quelli coltivati in sacchetti. Over-irrigazione dei sacchetti, come indicato da acqua stagnante nel fondo della sacca, può promuovere la crescita fungina e diminuire salute radice.
Con entrambi i dosaggi di valutazione ulteriore infestazione da nematodi e calcolo del numero di uova / sistema di radici e uova / grammo di freradice sh può essere eseguita. Per i saggi di pomodoro, le radici individuali vengono pesati e uova estratte come descritto per la preparazione inoculo (sezione 3). Durante l'elaborazione numero elevato di campioni di piante, sistemi radicali singoli potevano essere macerata usando un miscelatore per l'estrazione delle uova. Il numero di uova deve essere contato in almeno tre aliquote e le uova / grammo di sistema radice fresca calcolato. Per i saggi sacchetto, il sistema della radice viene tirato fuori il foglietto di carta, pesati, e uova estratte.
The authors have nothing to disclose.
La ricerca in Kaloshian laboratorio è finanziato da una sovvenzione da parte degli Stati Uniti National Institute of Food and Agriculture (2007-35607-17765). La ricerca in laboratorio Roberts è finanziata da sovvenzioni da Stati Uniti Agency for International Development (GDG-G-00-02-00012-00 e EDH-A-00-07-00005) e la California a secco Bean Advisory Board.
Compound | Concentration |
KNO3 | 5 mM |
Ca(NO3)2 • 4 H2O | 5 mM |
MgSO4 • 7H2O | 2 mM |
KH2PO4 | 1 mM |
Hamp-ene Fe EDTA 13.0% | 1 mM |
H3BO3 | 46 μM |
MnCl2 • 4H2O | 9 μM |
ZnSO4 • 7H2O | 0.00076 μM |
CuSO4 • 5H2O | 0.00032 μM |
(NH4)6Mo7O24 • 4H2O | 0.00016 μM |
Table 1. Reagents for Hoagland’s solution.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Erioglaucine | Fisher | AC22973-0250 | |
Miracle-Gro for tomato | Scotts Miracle-Gro | 18-18-21 | |
Osmocote | Scotts Miracle-Gro | ||
Seedling growth pouches | Mega International | ||
Sieve 25 μm | H & C Sieving Systems | 3886 | US standard #500 |
Sieve 90 μm | H & C Sieving Systems | 3880 | US standard #170 |
Sieve 425 μm | H & C Sieving Systems | 3871 | US standard #40 |
Sunshine mix | Sun Gro Horticulture Canada |
Table 2. Table of specific reagents and equipment.