Dos métodos distintos a las plantas de pantalla con nematodos, se describen. Los enfoques descritos son de alto rendimiento de las pantallas con los nematodos en una manera no destructiva para facilitar el uso de estas plantas en los programas de mejoramiento.
Los nematodos parásitos (del género Meloidogyne) son parásitos obligados de plantas. Son extremadamente polífaga y considerado uno de los nematodos parásitos de mayor importancia económica. El microscopio de la segunda etapa juvenil (J2), muda una vez en el huevo, es la etapa infecciosa. Los J2S salen de los huevos, se mueven libremente en el suelo dentro de una película de agua, y localizar puntas de las raíces de las especies vegetales adecuadas. Después de penetrar en la raíz de la planta, que migran hacia el cilindro vascular en el que establecer un sitio de alimentación e iniciar la alimentación con sus estiletes. El sitio de alimentación pluricelular está compuesto de varias células alargadas multinucleadas llamadas 'células gigantes' que se forman a partir de células que se sometieron a cariocinesis (se repite la mitosis) sin citocinesis. Las células vecinas periciclo dividir y ampliar de tamaño dando lugar a una agalla típica o nudo de la raíz, el síntoma característico de la infección por el nematodo agallador. Una vez que se inicia la alimentación, J2S una vida sedentaria y la ONUdergo tres mudas adicionales para convertirse en adultos. La hembra adulta pone 150-250 huevos en una matriz gelatinosa sobre o debajo de la superficie de la raíz. De los huevos eclosionan J2S nuevos infecciosos y comenzar un nuevo ciclo. El ciclo del nematodo del nudo de la vida se completa en 4-6 semanas a 26-28 ° C.
Aquí les presentamos el protocolo tradicional para infectar a las plantas, cultivadas en macetas con nematodos, y dos métodos de alto rendimiento ensayos. La primera de alto rendimiento método se utiliza para las plantas con semillas pequeñas como el tomate, mientras que el segundo es para las plantas con semillas grandes, como frijol caupí y común. Las semillas grandes apoyan el crecimiento de plántulas extendida con suplemento de nutrientes mínimos. El primer ensayo de alto rendimiento utiliza plántulas crecidas en arena en bandejas, mientras que en las plantas de ensayo segundo se cultivan en bolsas en la ausencia de suelo. El crecimiento de las plántulas bolsa está hecha de una mecha 15,5 x 12,5 cm de papel, doblada en la parte superior para formar un canal 2-cm de profundidad en la cual se coloca la semilla o las plántulas. Lamecha de papel se encuentra dentro de una bolsa de plástico transparente. Estas bolsas de crecimiento permiten la observación directa de síntomas de la infección por nematodos, escoriaciones de las raíces y la producción de masa de huevo, bajo la superficie de una bolsa transparente. Ambos métodos permiten el uso de las plantas examinadas, después de fenotipado, para el cruce o la producción de semillas. Una ventaja adicional del uso de bolsas de crecimiento es la necesidad de espacio pequeño, porque las bolsas de plástico se almacenan en carpetas colgantes dispuestos en bastidores.
Hay dos pasos fundamentales para una pantalla de nematodos éxito: preparación de un inóculo muy infecciosos y el uso de plantas en la etapa de desarrollo adecuado. Tasa de eclosión de huevos de nematodos nudo de la raíz es muy variable y oscila entre 5 a 50%. Por lo tanto para obtener niveles óptimos de escotilla y J2S altamente infecciosos, se debe prestar mucha atención a la extracción de huevos para incubar y de los procedimientos. Los huevos deben ser expuestos a cloro por un período mínimo de tiempo y cloro debe enjuagarse bien de la mezcla de las raíces. Cuando la eclosión de los huevos, la suspensión que contiene los huevos no deben ser sumergidas en agua. Además, evitar el derrame de los huevos en la caja de Petri subyacente, donde los juveniles nacidas son capturadas. Una forma de evitar el derrame de los huevos durante el proceso de incubación no es añadir agua directamente a la Kimwipe que el papel puede romperse. En su lugar se añade el agua directamente a la placa de Petri.
Para obtener los mejores resultados, utilice J2S recién nacidos. Si el HATCtasa h es baja y más inóculo se necesita, J2S puede ser almacenado a 15 ° C durante un período más largo. Caliente el inóculo almacenado a temperatura ambiente para revivir los nematodos antes de la inoculación. Sin embargo, no guarde los J2S durante períodos prolongados, incluso a 15 ° C como J2S muertos de hambre no se infectan de manera eficiente.
Las plántulas son la mejor etapa de desarrollo para la inoculación nematodo agallador. Sin embargo, esto tiene que ser equilibrada con la formación de un sistema radicular adecuado que proporcione un número suficiente de puntas de las raíces como puntos de entrada para los J2S. El mantenimiento de un estado óptimo crecimiento de las plantas también es fundamental para las pantallas. Evitar el exceso de riego las plantas especialmente los que crecen en las bolsas. El exceso de riego de las bolsas, como se indica por el agua estancada en la parte inferior de la bolsa, puede promover el crecimiento de hongos y disminuir salud de las raíces.
Con los dos ensayos de evaluación adicional de la infección por nematodos y el cálculo del número de huevos por sistema radicular y los huevos / gramo de frecuenciaraíz sh se puede realizar. Para los ensayos de tomate, las raíces individuales se pesan y se extrajeron los huevos como se describe para la preparación de inóculo (sección 3). Al procesar gran número de muestras de plantas, los sistemas individuales de raíz podría ser macerado utilizando un mezclador para la extracción de huevo. El número de huevos deben ser contados por lo menos en tres partes alícuotas y se calculan los huevos / gramo de sistema de raíces fresca. Para los ensayos de bolsa, el sistema de raíces es arrancado de la inserción de papel, se pesaron, y se extrajo huevos.
The authors have nothing to disclose.
La investigación en Kaloshian laboratorio está financiado por una donación de Estados Unidos Instituto Nacional de la Agricultura y la Alimentación (2007-35607-17765). La investigación en laboratorio de Roberts es un proyecto financiado por subvenciones de los Estados Unidos para el Desarrollo Internacional (GDG-G-00-02-00012-00 y A-EDH-00-07-00005) y la de California en seco de la Junta Consultiva frijol.
Compound | Concentration |
KNO3 | 5 mM |
Ca(NO3)2 • 4 H2O | 5 mM |
MgSO4 • 7H2O | 2 mM |
KH2PO4 | 1 mM |
Hamp-ene Fe EDTA 13.0% | 1 mM |
H3BO3 | 46 μM |
MnCl2 • 4H2O | 9 μM |
ZnSO4 • 7H2O | 0.00076 μM |
CuSO4 • 5H2O | 0.00032 μM |
(NH4)6Mo7O24 • 4H2O | 0.00016 μM |
Table 1. Reagents for Hoagland’s solution.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Erioglaucine | Fisher | AC22973-0250 | |
Miracle-Gro for tomato | Scotts Miracle-Gro | 18-18-21 | |
Osmocote | Scotts Miracle-Gro | ||
Seedling growth pouches | Mega International | ||
Sieve 25 μm | H & C Sieving Systems | 3886 | US standard #500 |
Sieve 90 μm | H & C Sieving Systems | 3880 | US standard #170 |
Sieve 425 μm | H & C Sieving Systems | 3871 | US standard #40 |
Sunshine mix | Sun Gro Horticulture Canada |
Table 2. Table of specific reagents and equipment.