2-Foton Mikroskopi kullanarak Fare Thymus intravital Görüntüleme

1. Hayvan hazırlık Önemli notlar: BM hücre süspansiyonları ve timik transplantasyon aseptik koşullarda yapıldı. Timik nakli hayvan tesis içinde yer alan cerrahi odasında yapıldı BM süspansiyonlar, hücre kültürü oda davlumbaz içinde hazırlandı. Bu aseptik koşullarda tutmak ve garanti altına almak için, biz bu yerlerin video kaydetmek için izin verilmiyordu. Ancak, tüm cerrahi malzemelerin otoklava ve daha önce cerrahi tezgah Virkon ® (Pharmacal Research Laboratories Inc) ve% 70 etanol ile temizlendi. Tüm işlemler onaylanmış ve Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi (IACUC) kullanın ve Avrupa Laboratuar Hayvan Bilimi Birlikleri (FELASA) direktifleri Federasyonu ile anlaşmaya vardı. Onay ID'niz AO10/2010. Tüm görüntü deneyler terminali prosedürleri ve hayvanlar görüntü sona ermesinin ardından hemen ötenaziedinimi. Ayrıntılı prosedür aşağıdaki gibidir: Işın tedavisi (γ ışınlama ile) kemik ilikleri (BM) içinde endojen hematopoietik öncüleri yok etmek için 900 rad ile 8 hafta eski Çıplak fareler. Intravenöz enjeksiyon ve daha fazla BM sulandırıldıktan için donör BM hücreleri hazırlamak kadar ışınlama sonra, kafesler, hayvanların geri. Bu BM transferi 1 saat ışınlama sonrası yapıldı. BM donör hayvanlar ayırın. Bir hayvanın arka bacaklarda tibiaları ve femur 3 alıcı hayvanlara sulandırmak için yeterli. CO 2 ile ötenazi sonra, arka bacaklarda kaldırmak ve sonra kemiklerinden kas ve deri kaldırın. Her kemik kapalı ucunu kesin ve BM kaldırmak için 2 ml PBS (ya da RPMI) bir havaneli kullanarak PBS (veya RPMI) ile yıkayın ya da bir havanda döv. Dinç aspirasyon USI tekrar tek bir hücre süspansiyonu içine BM yapısını bozabilirng P1000 pipet. Alternatif olarak, aynı zamanda bir 21G şırınga iğnesi boyunca birkaç kez BM geçebilir. Santrifüj (400g, 5 dakika, RT), PBS içinde hücre yeniden askıya alma, ve çıplak ışınlanmış alıcıları içine intravenöz enjekte. Deneylerde tüm düzenleyici T hücreleri (Tregs) GFP 1 ifade Foxp3-KI GFP / GFP fareler BM kullandı. -BM-sulandırılmış olmayan hayvanların 14 günden fazla yaşayamaz beri donör BM Kabul, transferinden sonra ilk günlerinde ortaya çıkar. Ancak, bir bütün BM bölmeleri tam iyileşme sağlamak için 4 ila 6 hafta beklemeniz gerekir. Bactrim (Roche) bakteriyel enfeksiyonların riskini azaltmak için ışınlama sonrası ilk hafta içinde (2 mg / ml) su eklendi. Embriyonik timus nakli zaten 2 tarif edilmiştir. Kısaca, isogenic farelerin üreme çiftleri başlayın ve her gün takarak (birleşmede kanıt) kontrol edin. Ayrı takılı kadın ve CO pregn gün 15 2-euthanizeANCY (fiş gözlem gebeliğin 1. gün). Embriyoların ve thymuses çıkarın. Transferi kadar soğuk PBS içinde embriyonik thymuses yerleştirin. Thymuses nakli, ketamin (120 mg / g fare ağırlık) / ksilizin (fare ağırlığı 16 mg / g) ile anestezi BM-alıcı Çıplak fareler gerçekleştirmek ve aldıkları 37 ° C kadar bir ısıtma yastığı üstünde tutmak için bilinçsiz. Cerrahi thymuses nakli gerçekleştirmek için böbrek maruz kalmaktadır. İlk ChloraPrep (Carefusion A.Ş.) ve% 70 etanol ile cilt fırçalayın. Daha sonra, hayvanın arka-lateral vücut parçası, 2 mm körüklü son torasik kaburga cilt üzerinde kesilmiş bir 1 cm. Periton boşluğuna kesin ve bu boşlukta böbrek çekin. Bir neşter bıçağı ile böbrek kapsülü küçük bir yüzeysel kesik olun. Çok ince bir ucu ile forseps kullanma alıcı fare böbrek kapsülü altında bir kese yapmak ve bu kese içine 4 timus lobları ekleyebilirsiniz. Böbrek b koyun yerine ack, bir ya da iki dikiş ile periton boşluğuna dikiş, ve daha sonra aynı dikiş yöntemi kullanarak fare deri yakın. Alternatif olarak, dikişlerle cerrahi yapıştırıcı kullanılarak yapılabilir. Subkutan sağ hayvan ağrıyı önlemek ve bunlar anestezi kurtarmak için başlayana kadar bir ısıtma pedi hayvanlar tutmak için ameliyat bittikten sonra (5 mg / kg butorfanol) analjezik enjekte edilir. Fareler kafes arkadaşları dikiş kaldırmasını önlemek için transplantasyon sonrası ilk 3 gün için ayrı ayrı kafesli. 1 hafta sonra dikişler çıkarın. Çıplak fareler, T hücreleri yoktur. Bu nedenle, kandaki CD4 + veya CD8 + T hücrelerinin yüzde izleme timus greft kabul değerlendirebilir. Haftada bir kez, 2 hafta timus naklinden sonra, hayvanların kanama ve anti-CD4 ve CD8 anti-monoklonal antikor (mAb) ile kan lekesi. CD4: CD8 oranı yaklaşık 2:1 'dir, nakledilen timus tamamen işlevseldir (Şekil 1). "> 2 intravital görüntü elde etme Önceden ihtiyaç ve onları bir kenara koyacağız tüm malzemeleri hazırlayın. 37 ketamin / xylazine (madde 1.5 açıklanan aynı dozlarda) ile hayvanların anestezisi ve bir ısıtma yastığı üstüne koyun ° C Kan akımının gelecekteki görselleştirme izin intravenöz rodamin B izotiyosiyanat-Dextran (PBS içinde 20 mg / ml) 100 ul enjekte edilir. Böbrek nakledilen timus içeren öğe 1.6, daha önce açıklanan protokole göre Açığa. Orijinal konumuna geri böbrek önlemek için dikiş ile cilt insizyonu lateral taraf kapatın. PBS batırılmış pamuk organın üstüne nemli tutmak için bir parça yerleştirin. Hayvan sahibinin aşama (Şekil 2A) üstüne ısıtma yastığı koyun. Hayvan, hayvan sahibi, organ kadar (Şekil 2B) ısıtma yastığı üstüne koyun. Her iki tarafta bir kelepçe m organ Pinchade ince alüminyum folyo (Şekil 2C). Hayvan sahibinin kapatın ve üst ısıtıcı prob doku (Şekil 2B) mümkün olduğunca yakın yerde. Bu ısıtıcı prob, sürekli bir organ sıcaklığı ölçer 37 ° C tutarak ısıtıcı, elektrik akımı ayarlamak için bu bilgileri gönderir PBS batırılmış pamuk çıkarın ve hazırlık üstünde 30 ° C düşük erime agaroz (PBS içinde% 2) ekleyin. Üst ısıtıcı (Şekil 2E) ile tüm hazırlık Kapak. Bu ısıtıcı diyafram objektif (Şekil 2F) agaroz izole bir coverglass vardır. Fare anestezi Monitör ve yarım doz artışı her 40 dakikada enjekte. Görüntü alımından sonra, CO 2 ile hayvan euthanize. Not: alüminyum folyo klip ve üst ısıtıcı resimleri Şekil 3'te sunulmaktadır. 3. İki foton görüntüleme satın alma Biz dik "Prairie Ultima XY" iki foton mikroskop kullanılır. Bizim sistemi ile donatılmış bir Ti: Safir lazer, aynı anda kadar 4 kanal satın almalar için en büyük dört Proje Yönetim Ekipleri ve 20x suya daldırma hedefi. Ti açın: Safir lazer ve tüm mikroskop sistemi. Dikroik aynalar ve filtre setleri istenilen dalga boyuna göre ekleyin. Bizim durumumuzda, 565 nm dikroik ayna içeren Olympus BX2 Chroma tutucu, bir 525/50 nm filtre (GFP Foxp3-sinyal için) ve 595/50 nm filtresi (Dextran-rodamin-B kan damarları içinde sinyali için kullanılan .) Kullanılan lazer dalga boyu aralığı 880-900 nm arasında idi. Hayvan sahibinin, mikroskop bağlamak ve suya, üst ısıtıcı diyafram üzerine su ekleyin, tüm ısıtıcıların amacı dikkatlice düşük çevirin, ve bir gemi ya da bazı GFP-Tregs odaklanmak. Mikroskop x, y, z dış kontrolü, hızlı bir bölge bulmak için doku anket çıkar. Proje Yönetim Ekipleri, renk ayrımı optimize ve arka plan üzerinde yeterli sinyal elde etmek için gerekli lazer miktarını en aza indirmek için kazanç ayarlayın. Doku fotoğraf zarar vermemek için lazer az miktarda kullanmaya çalışın. Çıkarlarını bölgede yer almaktadır sonra, time-lapse görüntüleme başlar. Bizim durumumuzda, tipik bir 5D (x, y, z, t ve renk) satın alma protokolü, 4.0 mikron z adımları, x ve y uzunluğu 140 mm ayrılır 50 mikron derinlik doku hacmi sıralı görüntüler elde oluşur her biri. Her cilt elde edilecek yaklaşık 30 saniye sürer. Bu nedenle, 60 satın almalar, yaklaşık 30 dakika görüntü alımı gerçekleştirecektir. Kurumsal sunucu, veri transferi ve çok boyutlu render ve hücre izleme gerçekleştirmek için ImageJ, Imaris, ya da Volocity yazılımı kullanmak. 4. Temsilcisi Sonuçlar g1.jpg "/> Şekil 1. Embriyonik timus kabul ve fonksiyon BM kurtardıktan sonra, embriyonik thymuses BM sulandırılmış hayvan nakledilen; timus nakli iki hafta sonra, bu farelerin anti-CD4 veya anti-CD8 T hücre alt tiplerinin yüzdeleri boyama ile izlemek için haftada bir kere kanadı Mablar. Biz timus CD4 hayvanlarda başarıyla kabul edilmiştir kabul 1.5-2.0:1 etrafında CD8 oranı (A). Işlevselliğini doğrulamak için, bazı timus nakledilen hayvanların kurban ve WT farelerin (B) ile farklı timosit alt popülasyonlarının yüzde karşılaştırıldığında. Alt popülasyonlar (anti-CD25 ve anti-CD44 Mablar ile boyama), çift-pozitif (DP; CD4 + CD8 + timositleri) (- CD8 timositleri CD4 DN) ve tek-pozitif (SP), CD4 çift-negatif yüzdeleri + veya CD8 + timositleri bu hayvanlar arasında benzer bulunmuştur. ig2.jpg "/> Şekil 2. Hayvan tutucu sonra derin anestezi, hayvan, bir ısıtma yastığı üstüne konur, daha önce hayvan sahibinin aşama (A) üst üste monte edilmiştir . Böbrek nakledilen timus içeren (B) yukarı bakacak. Bir alüminyum folyo kelepçe incelikle yerinde tutmak için tüm böbrek tutam (C). Şekil 1C insert kelepçe ayrıntılı olarak gösterir. Hayvan sahibinin üst kısmı yere (D) konur. PBS-batırılmış pamuk organın üst, sıcak düşük erime agaroz yerine kaldırılır ve üst ısıtıcı (E) eklenir. Son olarak, tüm montaj, mikroskop transfer hedefi (F) tarafından temsil edilen. Şekil 3. Tutucu parça Detayları Bu resimler, alüminyum folyo kelepçe (A) (B) böbrek tutarak gösteriyor . Nakledilen timus bulunduğu bölgenin de unutmayın. Bu yaklaşık olarak bölgenin gösterirtimus kapsül kesmek ve embriyonik timus koymak için cepte yapmak. Üst ısıtıcı coverglass (C) alt kısmı (D) silikon yapıştırıcı ile tespit edildi. Movie 1 Foxp3-GFP + timositleri fizyolojik oksijenlenme ve sıcaklık seviyeleri (37 ° C), tüm süreç boyunca tutuldu timus içinde intravital görüntüleme . Tregs kan akış ve hareket edin. Bu hızları ölçülen ve yayımlanmış verilere göre film görmek için buraya tıklayın. Film 2 görüntüleri 30 satın alındı ​​timus içinde Tregs intravital görüntüleme ° C Kan akımının bakım rağmen hareket ve yuvarlak şekil hücrelerin yokluğunda film görmek için buraya tıklayın.