Прижизненное Визуализация Мышь Thymus использованием 2-Фотон микроскопии

1. Животное подготовки Важные замечания: Б. М. суспензии клеток и трансплантации тимуса проводили в асептических условиях. Б. М. суспензий были подготовлены в капюшонах нашей комнаты культуры клеток, в то время пересадки тимуса проводили в хирургической комнате, расположенной в пределах наших животных объекта. Для того, чтобы сохранить и гарантировать эти асептических условиях, нам не разрешали записывать наше видео в этих местах. Однако, все хирургические материалы автоклавного и хирургических скамья была предварительно очищенные с Virkon (Pharmacal Research Laboratories Inc) и 70% этанола. Все процедуры были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC), и они были по согласованию с Федерацией европейских ассоциаций лабораторных животных науки (FELASA) директив. Номера официального утверждения идентификатор AO10/2010. Все эксперименты были изображения терминал процедур и животных были подвергнуты эвтаназии сразу же после окончания изображенияприобретения. Подробная процедура выглядит следующим образом: Радиация (с γ-излучатель) 8 неделя голым мышам с 900 рад уничтожить эндогенных гемопоэтических прекурсоров внутри костного мозга (КМ). После облучения, возвращение животных в своих клетках, пока вы готовите доноров БМ клеток для внутривенного введения и далее Б. М. разведения. Эта передача BM была выполнена через 1 ч после облучения. Отдельные Б. М. животных-доноров. Большеберцовые кости и бедра задних конечностей одного животного, как правило, достаточно, чтобы восстановить до 3-х животных получателя. После эвтаназии с СО 2, удалить задние конечности, а затем удалить кожу и мышцы от костей. Вырезать закрытом конце каждой кости и промойте его с PBS (или RPMI) или сокрушить их всех в ступке, с помощью пестика, с 2 мл PBS (или RPMI), чтобы удалить BM. Disrupt BM структуры в одной клеточной суспензии повторениями энергичного стремления USIнг пипетку P1000. Кроме того, вы можете также передать BM всей 21G иглу шприца в несколько раз. Центрифуга (400 г, 5 мин, RT), вновь приостановить клеток в PBS, и вводят внутривенно в ваши обнаженные облученных реципиентов. В наших экспериментах мы использовали BM от Foxp3-KI GFP / GFP мышей, где все регуляторные Т-клетки (Tregs) будет выражать GFP 1. Прием доноров Б. М. происходит в первые дни после перевода, так как не-БМ-восстановленного животные не могут прожить более 14 дней. Однако следует ждать от 4 до 6 недель, чтобы полностью восстановление всех БМ отсеков. Бактрим (Roche) был добавлен в воду (2 мг / мл) в течение первой недели после облучения для снижения риска бактериальных инфекций. Эмбриональные трансплантация тимуса уже было описано 2. Короче говоря, начать гнездящихся пар изогенных мышей и проверить его на подключение (свидетельство полового акта) каждый день. Отдельные женщины подключены и СО 2-усыпить их на 15-й день pregnancy (наблюдение вилка 1-й день беременности). Удалить эмбрионов и thymuses. Место эмбриональных thymuses в холодном PBS до передачи. Для выполнения thymuses трансплантации, обезболить БМ-получателя голым мышам с кетамин (120 мкг / г веса мыши) / ксилазина (16 мкг / г веса мыши) и держать их на вершине грелку при 37 ° С, пока они не без сознания. Хирургическим подвергать почки для выполнения трансплантации thymuses. Первая скраба кожу ChloraPrep (CareFusion Inc) и 70% этанола. Затем, чтобы 1 см порез на коже спины, боковой части тела животного, 2 мм ниже последних грудных ребер. Вырезать в брюшную полость и вынуть почки этой полости. Сделайте небольшой поверхностный порез в почечную капсулу с лезвие скальпеля. Использование щипцов с очень тонким кончиком сделать мешочек под почечную капсулу получателя мыши и добавить до 4-х долей тимуса в эту сумку. Положите почки б ACK на свое место, шовный брюшную полость с одной или двумя стежками, а затем закройте мыши кожи, используя тот же метод шва. Кроме того, швы можно сделать с помощью хирургического клея. Inject анальгетик (буторфанол в дозе 5 мг / кг) подкожно сразу после завершения операции, чтобы избежать боли животное и держать животных в грелку, пока они не начинают, чтобы оправиться от наркоза. Мыши клетке индивидуально в течение первых 3 дней после трансплантации, чтобы предотвратить клетке товарищей от снятия швов. Удалить стежками через 1 неделю. Обнаженная мышей не имеют Т-клеток. Таким образом, вы можете оценить тимуса принятия трансплантата путем мониторинга процент CD4 + или CD8 + Т-клеток в крови. Один раз в неделю, 2 недели после пересадки тимуса, кровоточить животных и пятна крови с анти-CD4 и анти-CD8 моноклональные антитела (МАТ). Когда CD4: CD8 составляет примерно 2:1, пересаженные тимус является полностью функциональной (рис. 1). "> 2. Прижизненное захвата изображений Подготовить все материалы, которые вы должны заранее и положить их в сторону. Анестезию животных с кетамин / ксилазина (тех же дозах описаны в п. 1.5) и разместить их на вершине грелку при 37 ° C. Inject 100 мкл родамина Б изотиоцианата-Декстран (20 мг / мл в PBS) внутривенно, чтобы для будущих визуализации кровотока. Выставляют почки содержащих пересаженных тимуса в соответствии с протоколом ранее описанных в пункте 1.6. Чтобы предотвратить почку от возвращения в исходное положение, закройте боковые стороны разреза кожи со швами. Место кусок PBS пропитанной хлопка в верхней части органа держать его влажным. Поместите грелку на вершине стадии животное держатель (рис. 2A). Положите животное на вершине грелку в животном держатель, орган (Рисунок 2B). Pinch органе в обе стороны с зажимом мфасад из тонкой алюминиевой фольги (рис. 2С). Закройте держатель животного и место топ зонд нагреватель как можно ближе к ткани (рис. 2D). Этот обогреватель зонд постоянно измеряет температуру органа и отправляет эту информацию на нагреватель для регулировки электрического тока, удерживая его при температуре 37 ° C. Удалить PBS пропитанной хлопка и добавить легкоплавких агарозы (2% в PBS) при 30 ° С на верхней части вашего препарата. Обложка целом препарат с верхний нагреватель (рис. 2Е). В отверстие на этот обогреватель есть покровного стекла изоляции агарозном от объективного (рис. 2F). Монитор мыши анестезией и вводят половину дозы повышение каждые 40 мин. После захвата изображений, усыпить животное с CO 2. Примечание: фотографии клип алюминиевой фольги и верхний нагреватель, представлены на рисунке 3. 3. Двухфотонное изображений приобретения Мы использовали вертикальное "Prairie Ultima XY" двухфотонного микроскопа. Наша система оснащена Ti: Sapphire лазер, четыре верхних ФЭУ для одновременного до 4 приобретений канала и 20-кратным погружения в воду цели. Включите Ti: Sapphire лазера и всей системы микроскопа. Добавить дихроичных зеркал и наборы фильтров в соответствии с длиной волны лучшего. В нашем случае мы использовали Олимп-BX2 Chroma держатель содержащих 565 нм дихроичных зеркал, одно 525/50 нм фильтра (для Foxp3-GFP сигнал), и один 595/50 нм фильтра (для Декстран-родамина-B сигнала внутри кровеносных сосудов ). Диапазон длины волны лазерного излучения использовался между 880 до 900 нм. Добавить животного владельцу микроскоп, подключения и включите все нагреватели, добавить воду на верхнее отверстие нагреватель, осторожно опустите цель в воду, и сосредоточиться на судно или какой-GFP-Tregs. С микроскопом х, у, г внешнего контроля, быстро исследование ткани, чтобы найти области интересов. Отрегулируйте прибыль от ФЭУ для оптимизации цветоделения и свести к минимуму количество лазерных, необходимых для достижения достаточной сигнала над фоном. Попробуйте использовать минимальное количество лазерных чтобы избежать фото-урон от ткани. Как только область интересов находится, начинаются покадровой съемки. В нашем случае, типичных 5D (х, у, г, т, и цвет) приобретение протокол состоит из последовательного приобретения изображения 50 мкм углубленного объема ткани, разделенное на 4,0 мкм Z-шагов, х и у, длиной 140 мкм каждая. Каждый том занимает около 30 секунд, чтобы быть приобретены. Таким образом, 60 приобретений будет выполнять около 30 мин получения изображений. Передача данных на институциональном сервер и использовать ImageJ, Imaris или Volocity программное обеспечение для выполнения многомерной визуализации и клетка слежения. 4. Представитель Результаты g1.jpg "/> Рисунок 1. . Эмбриональные тимуса принятие и функции После восстановления Б. М., эмбриональные thymuses были пересажены Б. М. восстановленного животных; через две недели после трансплантации тимуса, этих мышей брали кровь один раз в неделю контролировать процент Т подтипов ячейки путем окрашивания с анти-CD4 или анти-CD8 МАТ. Мы рассмотрели тимуса была успешно принята у животных с CD4: CD8 вокруг 1.5-2.0:1 (А). Чтобы убедиться в ее функциональности, мы пожертвовали некоторыми тимус-пересаженных животных и сравнили процент различных субпопуляций тимоцитов мышей с WT (B). Проценты дважды отрицательный (DN; CD4 – CD8 – тимоцитов) групп населения (путем окрашивания с анти-CD25 и анти-CD44 МКА), дважды положительными (DP; CD4 + CD8 + тимоцитов) и одним положительным (SP) CD4 + или CD8 + тимоцитов были похожи между этими животными. ig2.jpg "/> Рисунок 2. Сборка животных держателя. После глубоко под наркозом, животное помещается в верхней части грелку, ранее установленный на вершине этапе владельцу животного (). Почки содержащих пересаженных тимуса вверх (В). Зажим алюминиевой фольги деликатно щепотки целом почек (C), чтобы держать его на месте. Рис. 1С вставить подробно показывает зажимом. Верхняя часть животных держатель ставится на место (D). PBS-пропитанной хлопковой удаляется из верхней части органа, заменены теплой легкоплавких агарозы, и верхний нагреватель добавляется (E). Наконец, все собрание переносится на микроскоп, здесь представлены объективные (F). Рисунок 3. Информация о держателе частей. Эти фотографии показывают, зажим алюминиевой фольги (), являющихся владельцами почек (B). Отметим также, регион, где трансплантированные тимус находится. Это примерно указывает регионесократить тимуса капсулу и сделать карман положить эмбрионального тимуса. Верхнего покровного стекла нагреватель (С) была зафиксирована с силиконовым клеем, чтобы его нижняя часть (D). Фильм 1. Прижизненное изображений Foxp3-GFP + тимоцитов в тимусе, где физиологические уровни кислорода и температуры (37 ° С) сохраняется в течение всего процесса. Обратите внимание на кровоток и движение Tregs. Эти скорости могут быть измерены и по сравнению с литературными данными. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм. Фильм 2. Прижизненное изображений Tregs внутри тимуса, где изображения были получены при температуре 30 ° C. Обратите внимание на отсутствие движения и округлой формы клеток, несмотря на поддержание кровотока. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм.