Nous avons développé des outils de laboratoire roman et de protocoles pour l'acquisition d'imagerie intravitale du thymus. Notre technique devrait aider à l'identification de «niches» dans le thymus où le développement des cellules T se produit.
Microscopie à deux photons (TPM) offre d'acquisition d'image dans les zones profondément à l'intérieur des tissus et des organes. En combinaison avec le développement d'outils et de nouvelles procédures stéréotaxique chirurgicale, TPM devient une technique performante pour identifier des «niches» à l'intérieur des organes et de documenter cellulaire "comportements" des animaux vivants. Alors que l'imagerie intravitale fournit des informations qui ressemble le mieux le comportement réel cellulaire à l'intérieur de l'orgue, il est à la fois plus laborieux et techniquement exigeants en termes d'équipement requis / procédures d'acquisition de l'ex alternatives imagerie in vivo. Ainsi, nous décrivons une nouvelle procédure chirurgicale et titulaire »stéréotaxique" organe qui nous permet de suivre les mouvements des cellules Foxp3 + dans le thymus.
Foxp3 est le régulateur maître pour la génération de cellules T régulatrices (Treg). Par ailleurs, ces cellules peuvent être classés selon leur origine: c'est à dire. thymus différenciés Tregs sont appelés «naturels Tregs" (nTregs), que l'opposed au périphérique convertis Tregs (pTregs). Bien que beaucoup de recherches ont été rapportés dans la littérature concernant le phénotype et la physiologie de ces cellules T, on sait très peu sur leurs interactions in vivo avec d'autres cellules. Cette carence peut être due à l'absence de techniques qui permettraient de telles observations. Le protocole décrit dans ce document fournit un remède à cette situation.
Notre protocole consiste à utiliser des souris nude qui n'ont pas d'thymus endogènes car ils ont une mutation ponctuelle dans la séquence d'ADN qui compromet la différenciation de certaines cellules épithéliales, y compris les cellules épithéliales thymiques. Souris Nude ont été irradiés par rayons gamma et reconstituées avec des courges osseuse (MO) de Foxp3-KI GFP / GFP souris. Après la récupération BM (6 semaines), chaque animal a reçu la transplantation embryonnaire du thymus à l'intérieur de la capsule rénale. Après l'acceptation du thymus (6 semaines), les animaux ont été anesthésiés; le rein contenant lesthymus transplanté a été exposé, fixée dans notre porte-orgue, et maintenu dans des conditions physiologiques pour l'imagerie in vivo par TPM. Nous avons utilisé cette approche pour étudier l'influence de drogues dans la génération de cellules T régulatrices.
Dans ce papier, nous avons démontré les procédures d'imagerie à deux photons de thymocytes dans un animal vivant. Nous avons également décrit certains paramètres que l'on doit contrôler soigneusement, comme la continuation du flux sanguin et le maintien de la température de l'organe pendant les procédures d'imagerie. Néanmoins, malgré les efforts de soin de garder l'orgue stable, les artefacts de mouvement tels que «l'organe à la dérive» peut se produire. Correction d'image postérieure peut être effectuée par le développement d'algorithmes spécialement conçu à cet effet. L'analyse d'images supplémentaires pourraient également être la source du développement de nouveaux protocoles qui cherche à minimiser les erreurs.
Le thymus est l'organe où toutes les cellules T sont produites et, par conséquent, il est l'organe où immunologistes intéressés à comprendre la génération de γδ, lymphocytes CD4 ou lymphocytes T CD8 se concentreront leur attention. La plupart des études concernant les cellules T sont basées sur des différences dans le nombre et / ou la stabilité de ces caunes, après différents in vitro / in vivo des manipulations. Cependant, seulement après la visualisation in vivo nous avons pu observer l'interaction entre les cellules du système immunitaire impliquées dans le maintien de l'homéostasie 3-7. Par conséquent, l'observation in vivo des thymocytes est probablement l'une des informations les plus importantes manquent pour mieux comprendre la biologie des cellules T. Intravitale TPM fournit une image détaillée des mouvements des cellules T et les interactions, et nous démontrons ici comment il peut être utilisé pour des études détaillées thymocytes. Cependant, chaque technique a ses limites. Alors que l'acquisition d'imagerie intravitale est le système le plus précis pour refléter le comportement des cellules à l'intérieur du corps, il est vrai aussi que l'acquisition d'images explantées d'organes est moins laborieuse et a été utilisé pour recueillir des informations importantes sur le système immunitaire 8,9. Par ailleurs, on ne peut nier les méthodes d'imagerie intravitale nécessiter une intervention chirurgicale afin d'exposer les tissus et les vaisseaux sanguins chez les animaux anesthésiés,qui en soi pourrait entraîner une altération de l'organe entier la physiologie 10. Néanmoins, il existe des méthodes non-invasive qui abolissent les artefacts causés par l'intervention chirurgicale 11 et de nouvelles méthodes sont en cours de développement à mieux se préparer à l'avance les animaux devant être utilisés 12. Par conséquent, de nouvelles procédures chirurgicales et des péages sera de minimiser ou de contourner les limitations réelles de l'acquisition d'imagerie intravitale et deviennent de plus en plus accessible à la communauté scientifique.
Nous avons démontré que la méthode que nous avons décrit est faisable et ce tous les rapports des manipulations in vivo systémique, l'administration de médicaments tels, que nous avons utilisés. Ainsi, nous suggérons l'utilisation de cette méthode ainsi que des techniques ex vivo déjà disponibles afin de compléter et renforcer d'autres études concernant le développement des thymocytes.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier le Dr David Olivieri pour un examen critique de ce manuscrit, le Dr Nuno Moreno pour l'aide logistique pour construire notre porte-animal et les coussins chauffants et Dr. Vijay K. Kuchroo pour le don en nature de Foxp3-KI GFP / GFP souris. Ce travail est soutenu par «Fundação para Ciência Tecnologia e" (CFPI, Portugal), subvention no PTDC/EBB-BIO/115514/2009.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Rhodamine B ishothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | prepare stock at 20 mg/ml |
Two-photon microscope | Prairie Technologies Inc. | Prairie Ultima X-Y | |
Ti:Sapphire laser | Coherent, Inc. | Chameleon Ultra Family | |
20x/1.00 NA immersion objective | Olympus Inc. | XLUMPLFLN 20XW | |
Holder (Filters/Dichroic) | Chroma Technology Corp. | 91018 BX2 (U-MF2) | |
525 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET525/50m | |
595 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET595/50m | |
565 nm dichroic | Chroma Technology Corp. | 565dcxr | |
Imaris software | Bitplane AG Inc. | Imaris | |
Volocity | PerkinElmer Inc. | Volocity | |
ImageJ | NIH, USA | ImageJ |