Imagen intravital del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopy

1. Animal preparación Notas importantes: BM suspensiones celulares y trasplantes de timo se han realizado en condiciones asépticas. Las suspensiones se prepararon BM dentro de las campanas de la sala de cultivo celular, mientras que el trasplante de timo se llevó a cabo en la sala de operaciones ubicado dentro de nuestras instalaciones para animales. A fin de mantener y garantizar estas condiciones asépticas, no se nos permitió grabar nuestro video en esos lugares. Sin embargo, todo el material quirúrgico se autoclave y el banco quirúrgica fue limpiada previamente con Virkon (Pharmacal Research Laboratories, Inc.) y el 70% de etanol. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional y el empleo Comisión (IACUC) y que estaban de acuerdo con la Federación Europea de Asociaciones de Ciencia Animal de Laboratorio (FELASA) directivas. El número de identificación de aprobación es AO10/2010. Todos los experimentos de imagen fueron los procedimientos terminales y los animales fueron sacrificados inmediatamente después del final de la imagenadquisición. El procedimiento detallado es el siguiente: Irradiar (con γ-irradiador) 8 semanas de edad ratones atímicos con 900 rads para destruir los precursores hematopoyéticos endógena dentro del hueso calabacines (BM). Después de la irradiación, el retorno de los animales a sus jaulas hasta que preparar las células del donante BM para inyección intravenosa y la reconstitución BM más. Esta transferencia se realizó BM 1 h después de la irradiación. Separar los animales donantes BM. Tibias y fémures de las patas traseras de un animal son generalmente suficientes para reconstituir hasta 3 animales receptores. Después de la eutanasia con CO 2, quite las patas traseras y luego retire la piel y los músculos de los huesos. Corte el extremo cerrado de cada hueso y enjuague con PBS (o RPMI) o aplastar a todos en un mortero, usando una mano de mortero, con 2 ml de PBS (o RPMI) para eliminar el BM. Alterar la estructura BM en una suspensión de una sola célula por la repetición de la aspiración vigorosa using una pipeta P1000. Si lo prefiere, también puede pasar el BM a través de una aguja de la jeringa 21G en varias ocasiones. Se centrifuga (400 g, 5 min, RT), volver a suspender las células en PBS, y se inyecta por vía intravenosa en el nude-irradiados destinatarios. En nuestros experimentos hemos utilizado BM de Foxp3-KI GFP / GFP ratones en todas las células T reguladoras (Tregs) se expresan GFP 1. La aceptación de la BM de los donantes se produce en los primeros días después de la transferencia, ya que no-BM-reconstituido animales no pueden sobrevivir más de 14 días. Sin embargo, se debe esperar de 4 a 6 semanas para permitir la recuperación plena de todos los compartimentos BM. Bactrim (Roche) fue introducido en el agua (2 mg / ml) durante la primera semana después de la irradiación para disminuir el riesgo de infecciones bacterianas. Timo embrionario trasplante ya ha sido descrito 2. En pocas palabras, empezar a criar pares de ratones isogénicas y comprobar para conectar (pruebas del coito) todos los días. Mujeres por separado y conectado a CO 2-eutanasia en el día 15 de pregnAncy (observación de enchufe es el día 1 de embarazo). La toma de embriones y timos de la. Coloque los timos de embriones en PBS frío hasta que la transferencia. Para llevar a cabo el trasplante de timo, anestesiar BM-receptor ratones desnudos con ketamina (120 mg / g de peso del ratón) / xilazina (16 mg / g de peso del ratón) y mantenerlos en la cima de una almohadilla térmica a 37 ° C hasta que se inconsciente. Exponer quirúrgicamente el riñón para realizar el trasplante de los timos. Primero frote la piel con ChloraPrep (CareFusion Inc.) y el 70% de etanol. Entonces, hacer un corte de 1 cm en la piel de la parte del cuerpo posterior-lateral del animal, de 2 mm por debajo de la costilla torácica anterior. Cortar la cavidad peritoneal y sacar el riñón de esta cavidad. Hacer un pequeño corte superficial en la cápsula renal con una hoja de bisturí. El uso de pinzas con una punta muy fina que una bolsa debajo de la cápsula del riñón del ratón receptor y añadir hasta 4 lóbulos del timo en esta bolsa. Coloque la b riñón acuse de recibo a su lugar, la sutura de la cavidad peritoneal con uno o dos puntos de sutura y cierre de la piel del ratón usando el método de sutura mismo. Por otra parte, las suturas se puede hacer usando pegamento quirúrgico. Inyectar analgésico (butorfanol a 5 mg / kg) por vía subcutánea justo después de terminar la cirugía para evitar el dolor de los animales y mantener a los animales en un cojín de la calefacción hasta que empiezan a recuperarse de la anestesia. Los ratones son alojados en jaulas individuales para los 3 primeros días después del trasplante para evitar que sus compañeros de jaula de la eliminación de los puntos de sutura. Quitar puntos de sutura después de 1 semana. Ratones desnudos no tienen células T. Por lo tanto, se puede evaluar la aceptación del trasplante de timo mediante el control del porcentaje de células CD4 + o linfocitos T CD8 + en la sangre. Una vez por semana, 2 semanas después de trasplante de timo, sangrar a los animales y la mancha de sangre con anticuerpos anti-CD4 y CD8 anti-anticuerpos monoclonales (MAb). Cuando los CD4: CD8 es de aproximadamente 2:1, el timo trasplantado es totalmente funcional (Figura 1). "> 2. Adquisición de la imagen intravital Prepare todos los materiales que se necesitan por adelantado y puso a un lado. Anestesiar a los animales con ketamina / xilazina (mismas dosis descritos en el punto 1.5) y colocarlos en la parte superior de un cojín de la calefacción a 37 º C. Inyectar 100 l de rodamina B isotiocianato de dextrano (20 mg / ml en PBS) por vía intravenosa para permitir la visualización de futuro, el flujo de sangre. Exponer el riñón que contiene el timo trasplantados de acuerdo con el protocolo previamente descrito en el punto 1.6. Para evitar que los riñones vuelvan a su posición original, cerca de las caras laterales de la incisión de la piel con puntos de sutura. Coloque un trozo de algodón empapado de PBS en la parte superior del órgano para mantenerlo húmedo. Ponga la almohadilla en la parte superior de la etapa de titular de animales (Figura 2). El sacrificio del animal en la parte superior de la almohadilla en el soporte de los animales, por órgano (Figura 2B). Pellizcar el órgano en ambos lados con una abrazadera de mADE de papel de aluminio delgado (Fig. 2C). Cierre el soporte de los animales y el lugar de la sonda de calor superior lo más cerca posible a los tejidos (Figura 2). Esta sonda de calor mide constantemente la temperatura de órganos y envía esta información al calentador para ajustar la corriente eléctrica, manteniéndolo a 37 ° C. Retire el algodón empapado en PBS y añadir bajo punto de fusión de agarosa (2% en PBS) a 30 ° C en la parte superior de su preparación. Cubrir toda la preparación con el calentador superior (Figura 2E). En la apertura de este calentador hay un cubreobjetos aislar la agarosa del objetivo (Figura 2F). Monitor de la anestesia del ratón e inyectar un impulso a mitad de dosis cada 40 minutos. Después de la adquisición de la imagen, la eutanasia de los animales con CO 2. Nota: las imágenes del clip de papel de aluminio y el calentador superior se presentan en la Figura 3. 3. De dos fotones de imagen de adquisición Se utilizó un pie "Prairie Ultima XY" microscopio de dos fotones. Nuestro sistema está equipado con un Ti: Sapphire láser, cuatro PMT parte superior de traducción simultánea de hasta 4 canales de adquisiciones y un objetivo de inmersión en agua 20x. Encienda el Ti: Zafiro con láser y el sistema de microscopio conjunto. Añadir espejos dicroicos y juegos de filtros de acuerdo a las longitudes de onda deseada. En nuestro caso hemos utilizado un titular de Chroma-Olympus BX2 que contiene un espejo de 565 nm dicroicos, un 525/50 nm filtro (para la señal de Foxp3-GFP), y un 595/50 nm filtro (por Dextran-Rodamina-B de la señal dentro de los vasos sanguíneos ). El rango de longitud de onda de láser utilizado fue entre 880 a 900 nm. Añadir el titular de los animales al microscopio, conectar y encender todas las estufas, se añade agua en el calentador de la apertura superior, baje cuidadosamente el objetivo en el agua, y se centran en un buque o algún Tregs GFP. Con el microscopio de x, y, z de control externo, de forma rápida encuesta el tejido para localizar una región de interés. Ajustar la ganancia de la PMT para optimizar la separación de colores y minimizar la cantidad de láser necesarios para lograr suficiente señal más de fondo. Trate de usar la mínima cantidad de láser para evitar la foto-daño de los tejidos. Una vez que la región de interés se encuentra, hora de inicio de imágenes a intervalos. En nuestro caso, un típico 5D (x, y, z, t, y el color) protocolo de adquisición consiste en la adquisición de imágenes secuenciales de un volumen de 50 micras de tejido profundo, divididos en 4,0 m z-pasos, x y la longitud y de 140 micras cada uno. Cada volumen es de unos 30 segundos para ser adquiridos. Por lo tanto, 60 adquisiciones se realizan alrededor de 30 minutos de la adquisición de imágenes. Transferir los datos al servidor institucional y el uso de ImageJ, Imaris o software Volocity para llevar a cabo la representación multi-dimensional y el seguimiento de la célula. 4. Resultados representante g1.jpg "/> Figura 1. . Embrionarias aceptación del timo y la función BM Después de recuperarse, timos embrionarias fueron trasplantadas a animales BM reconstituido, dos semanas después del trasplante de timo, estos ratones fueron sangrados una vez por semana para supervisar los porcentajes de los subtipos de células T mediante la tinción con anti-CD4 o anti-CD8 los anticuerpos monoclonales. Se consideró que el timo fue aceptado con éxito en animales con CD4: CD8 alrededor 1.5-2.0:1 (A). Para confirmar su funcionalidad, que sacrificó algunos animales timo-trasplante y en comparación el porcentaje de las diferentes subpoblaciones de timocitos de ratones WT (B). Los porcentajes de doble negación (DN; CD4 – CD8 – timocitos) subpoblaciones (por tinción con anti-CD25 y anticuerpos monoclonales anti-CD44), haga doble positivo (DP; CD4 + CD8 + timocitos) y de un solo positivo (SP) CD4 + o CD8 + timocitos fueron similares entre estos animales. ig2.jpg "/> Figura 2. Conjunto de animales titular. Después profundamente anestesiados, el animal se pone encima de una almohadilla eléctrica, previamente montada en la parte superior de la etapa de titular de animales (A). El riñón trasplantado que contiene el timo es hacia arriba (B). Una pinza de papel de aluminio con delicadeza aprieta todo el riñón (C) para mantener en su lugar. Fig. 1C insertar muestra en detalle la abrazadera. La parte superior del soporte de los animales se pone en el lugar (D). El algodón empapado en PBS se retira de la parte superior del órgano, sustituido por el cálido bajo punto de fusión de agarosa, y el calentador superior se añade (E). Finalmente, toda la asamblea se transfiere al microscopio, en este caso representado por el objetivo (F). Figura 3. Detalles de las piezas soporte. Estas imágenes muestran la abrazadera de papel de aluminio (A) la celebración de los riñones (B). Tenga en cuenta también la región donde se encuentra el timo trasplantado. Esto indica aproximadamente la regiónpara cortar la cápsula del timo y hacer que el bolsillo para poner el timo embrionario. El cubre calentador superior (C) se fija con pegamento de silicona en su parte inferior (D). Movie 1. Intravital imagen de GFP-Foxp3 + timocitos en el interior del timo, donde los niveles fisiológicos de la oxigenación y la temperatura (37 ° C) se mantuvieron durante todo el proceso. Tenga en cuenta el flujo de sangre y el movimiento de células T reguladoras. Estas velocidades pueden ser medidos y comparados con los datos publicados. Haga clic aquí para ver la película. Movie 2. Intravital de imágenes de células T reguladoras dentro de un timo, donde las imágenes fueron adquiridas a 30 ° C. Nótese la ausencia de movimiento y de la forma redonda de las células a pesar del mantenimiento del flujo sanguíneo. Haga clic aquí para ver la película.