הפצת ועל גילוי Clone מולקולרית זיהומיות של וירוס Maedi-visna המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק
Summary
אנו מתארים שיבוט מולקולרי של הנגיף maedi-visna המבטא GFP ו מדבק לחלוטין. שכפול של וירוס זה ניתן לגילוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry הזרימה.
Abstract
Maedi-visna וירוס (MVV) הוא lentivirus כבשים, גורם לדלקת ריאות ביניים מתקדמת לאט דלקת קרום המוח 1. התאים היעד העיקרי של MVV in vivo נחשבים של 2 את השושלת מונוציטים. זנים מסוימים של MVV יכול לשכפל סוגי תאים אחרים, לעומת זאת 3,4. חלבון פלואורסצנטי ירוק הוא סמן הנפוץ לחקר lentiviruses בתאים חיים. אנחנו צריכים להכניס את הגן egfp לתוך הגן עבור dUTPase של MVV. הגן dUTPase נשמרת היטב זנים lentivirus ביותר צאן ו הוכח להיות חשוב שכפול של CAEV 5. עם זאת, dUTPase הוכח להיות מיותר עבור שכפול של שיבוט מולקולרי של MVV השתמשו במחקר זה הן במבחנה in vivo 6. שכפול MVV מוגבל אך ורק תאים של כבש או עז מוצא. אנו משתמשים בקו התא הראשוני של מקלעת דמית העין של כבשים (תאים SCP) עבור transfection ואת התפשטות של הנגיף 7. MVV פלורסנט מדבק מלא הבעה EGFP יציב על לפחות 6 קטעים 8. קיימת קורלציה טובה בין מדידות של TCID 50 ו EGFP. וירוס זה ולכן צריך להיות שימושי עבור זיהוי מהיר של תאים נגועים במחקרים של כמיהות התא pathogenicity במבחנה in vivo 8.
Protocol
Discussion
GFP להביע שיבוט מולקולרי של MVV המוצגים כאן צריך להיות שימושי לניתוח מארח תאים אינטראקציות pathogenicity של MVV הן במבחנה in vivo. הווירוס מתקבל לאחר 7-14 ימים של שכפול רכשה ללא ספק כמה מוטציות עקב אי דיוק של reverse transcriptase. עם זאת, ישנן מגבלות על השימוש שיבוט זה כמו וקטור מחזור אחד. האחת …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי קרן המחקר האיסלנדי של אוניברסיטת קרן מחקר איסלנד.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Gibco | 10938025 |
| Opti-MEM | Gibco | 51985018 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 |
References
- Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).
- Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes. J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).
- Andresdottir, V. Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus. Virus Genes. 16, 281-293 (1998).
- Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence. Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).
- Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions. J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).
- Petursson, G. Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity. J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).
- Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. Cultivation of visna virus in tissue culture. Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).
- Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein. J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).
- Andresson, O. S. Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus. Virology. 193, 89-105 (1993).
- Skraban, R. Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype. J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
- Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity. Virology. 279, 116-129 (2001).
