Teeltmateriaal en Detecteren van een besmettelijke moleculaire kloon van Maedi-visna virus dat Green Fluorescent Protein geeft uiting aan
Summary
Beschrijven we een moleculaire kloon van maedi-visna virus dat GFP tot uitdrukking en is volledig besmettelijk. Replicatie van dit virus kan worden gedetecteerd door gebruik te maken van fluorescentie microscopie en flowcytometrie.
Abstract
Maedi-visna virus (MVV) is een lentivirus van schapen, waardoor langzaam progressieve interstitiële pneumonie en encefalitis 1. Het primaire doel cellen van MVV in vivo worden beschouwd als van de monocyten Lineage 2. Bepaalde stammen van MVV kunnen repliceren in andere celtypen, maar 3,4. De groen fluorescerend eiwit is een veelgebruikte marker voor het bestuderen van lentivirussen in levende cellen. Wij hebben geplaatst het EGFP-gen in het gen voor dUTPase van MVV. De dUTPase gen is goed geconserveerd in de meeste lentivirus stammen van schapen en geiten en is aangetoond dat het belang in de replicatie van CAEV 5. Er is echter dUTPase aangetoond dat misbaar voor replicatie van de moleculaire kloon van MVV die in deze studie zowel in vitro als in vivo 6. MVV-replicatie is strikt beperkt tot cellen van schapen of geiten herkomst. We maken gebruik van een primaire cel lijn van de plexus choroideus van schapen (SCP cellen) voor transfectie en vermeerdering van het virus 7. De fluorescerende MVV is volledig aanstekelijk en EGFP expressie is stabiel gedurende tenminste zes passages 8. Er is een goede correlatie tussen de metingen van TCID 50 en EGFP. Dit virus zou dan ook handig zijn voor snelle detectie van geïnfecteerde cellen in studies van celtropisme en pathogeniciteit in vitro en in vivo 8.
Protocol
Discussion
De GFP uitdrukken moleculaire kloon van MVV hier gepresenteerde moet nuttig zijn voor het analyseren van de gastheer-cel interacties en pathogeniteit van de MVV zowel in vitro als in vivo. Het virus verkregen na 7-14 dagen van replicatie heeft ongetwijfeld verworven sommige mutaties als gevolg van de onnauwkeurigheid van reverse transcriptase. Er zijn echter beperkingen aan het gebruik van deze kloon als een enkele cyclus vector. Een daarvan is dat het gebruik van de kloon is beperkt tot cellen van schapen en geiten oor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de IJslandse Research Fund en de Universiteit van IJsland Research Fund.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Gibco | 10938025 |
| Opti-MEM | Gibco | 51985018 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 |
References
- Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).
- Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes. J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).
- Andresdottir, V. Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus. Virus Genes. 16, 281-293 (1998).
- Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence. Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).
- Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions. J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).
- Petursson, G. Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity. J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).
- Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. Cultivation of visna virus in tissue culture. Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).
- Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein. J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).
- Andresson, O. S. Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus. Virology. 193, 89-105 (1993).
- Skraban, R. Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype. J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
- Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity. Virology. 279, 116-129 (2001).
