وكشف ونشر استنساخ المعدية الجزيئية لفيروس ميثة-فيزنا أن تعرب عن بروتين الفلورية الخضراء
Summary
وصفنا استنساخ الجزيئية لفيروس ميثة-فيزنا التي تعبر عن GFP والمعدية بالكامل. ويمكن الكشف عن هذا الفيروس من التكرار باستخدام المجهر مضان والتدفق الخلوي.
Abstract
ميثة-فيزنا فيروس (MVV) هو الفيروسة البطيئة من الأغنام، مما تسبب الالتهاب الرئوي الخلالي والتهاب الدماغ ببطء تدريجي 1. وتعتبر الخلايا الهدف الرئيسي من MVV في الجسم الحي لتكون من 2 نسب الوحيدات. وهناك سلالات معينة من MVV تكرار في أنواع الخلايا الأخرى، ولكن 3،4. البروتين الأخضر نيون هو علامة شائعة الاستخدام لدراسة lentiviruses في الخلايا الحية. أدرجت ونحن الجين EGFP في جين dUTPase من MVV. يتم حفظها بشكل جيد الجين dUTPase في معظم سلالات الفيروسة البطيئة من الأغنام والماعز ولقد ثبت أن تكون مهمة في تكرار CAEV 5. ومع ذلك، فقد تبين أن dUTPase الاستغناء عن تكرار استنساخ الجزيئي للMVV المستخدمة في هذه الدراسة سواء في التجارب المختبرية والحية 6. ويقتصر بدقة MVV النسخ المتماثل لخلايا المنشأ الأغنام أو الماعز. نستخدم خط الخلية الأولية من الضفيرة المشيمية من الأغنام (الخلايا SCP) لترنسفكأيشن ونشر الفيروس 7 </ سوب>. وMVV الفلورسنت هو المعدية بالكامل والتعبير EGFP وهو يستقر على مدار لا يقل عن 6 مقاطع 8. هناك علاقة جيدة بين قياسات TCID 50 و EGFP. يجب أن هذا الفيروس يكون من المفيد للكشف السريع عن الخلايا المصابة في دراسات الخلايا وtropism المرضية في التجارب المختبرية والحية 8.
Protocol
Discussion
ينبغي أن GFP التعبير عن استنساخ الجزيئي للMVV المقدمة هنا تكون مفيدة لتحليل التفاعلات المضيف الخلية وتسببها MVV سواء في التجارب المختبرية والحية. اكتسب الفيروس تم الحصول عليها بعد 7-14 أيام من تكرار بعض الطفرات دون شك نظرا لعدم دقة الناسخ العكسي. ومع ذلك، هناك قيود على است?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل صندوق البحث الأيسلندية وجامعة أيسلندا صندوق البحث.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Gibco | 10938025 |
| Opti-MEM | Gibco | 51985018 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 |
References
- Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).
- Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes. J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).
- Andresdottir, V. Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus. Virus Genes. 16, 281-293 (1998).
- Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence. Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).
- Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions. J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).
- Petursson, G. Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity. J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).
- Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. Cultivation of visna virus in tissue culture. Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).
- Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein. J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).
- Andresson, O. S. Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus. Virology. 193, 89-105 (1993).
- Skraban, R. Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype. J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
- Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity. Virology. 279, 116-129 (2001).
