E13 farelerin Glial Yasak Öncüleri türetilmesi

Giriş Bu protokolü biz E13 fare fetusların omurilikten glial kısıtlı öncüsü (CTP) hücreleri, ayıklamak seçin ve plaka nasıl gösterir. Bu hücreler oligodendrocytic ve astrositik hücre soyları içindeki erken öncüleri olan ve A2B5 bunların ifadesi tarafından tanımlanır. FGF-2 ile takviye CTP ortamda, A2B5 + GRP erken oligodendrocytic soy işaretleri PDGFαR ve NG2 1,2 ifade başlayacak. Bu oligodendrosit soyu hücreleri, ayrı fenotipik aşamaları, morfolojik değişimler, aynı zamanda belirli bir gelişme aşamasına belirteçlerinin ifadesi ile karakterize edilen, her biri bir dizi geçer. Bu öncül hücreler henüz multipl skleroz, lökodistrofiler ve periventriküler lökomalazi (PVL) 3,4,5,6 dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi beyaz cevher hastalıklarında hücre tabanlı tedavi yaklaşımları için potansiyel bir kaynak olarak çalışılmaktadır </s> kadar. Oligodendrosit soy öncüleri edilen insan beyni kullanılarak yapılan çalışmalar shiverer fare dysmyelination modeli beyinlerinde yanı sıra demyelinated omurilik kemirgen modelleri 6,7,8,9 başarılı remiyelinizasyon bildirdin. Bunlar, glial prekürsör hücreleri gibi omurilik hasarı ve kas erimesiyle ilgili lateral skleroz 10,11,12,13 gibi diğer beyaz madde hastalığı modellerinin çalışmalarda da kullanılmıştır. Laboratuvarımız biz PVL, serebral palsi 14,15,16 önde gelen nedeni bir restoratif yaklaşım olarak CTP türetilen bu hücrelerin omurilik etkinliğini değerlendiren hangi bir erken postnatal hipoksi-iskemi fare modeli geliştirmiştir. CTP hücreleri astrositik yolunun 17 içine ayırt etmek için bir eğilim var bu yana yaygın olarak beyaz cevher hasarı incelemek için kullanılmış olan OPC modeli edilen bir kemirgen beyin de var. OPC fenotip zaten oligodendrosit soy yolu, irreve görünüyor bir fenomen girdirsible. Ancak, GRP ve hatta E10.5 de elde NEP dahil oligodendrosit öncüllerinden daha geniş bir spektrum yanıtı değerlendirirken ilgileniyorlar. Bu nedenle yaptığımız işi için omurilik edilen CTP modelini benimsedik. Hücre değiştirilmesi için GRP kullanımı yanı sıra, beyaz madde hastalıkların vahşi tip ve transjenik kemirgen modellerden bu hücrelerin in vitro türetilmesi ortamda bir normal ve hastalık koşullar altında glial farklılaşma içine daha fazla çalışma sağlar. Önceki yayınlar olgunlaşma bağımlı glutamat eksitotoksik, oksidatif stres ve nöro-inflamasyonu 18,19 karıştığı seçin faktörler gibi çeşitli dış stresörlere oligodendrocytic soy öncü hücrelerin seçici açığına delil göstermek. Çalışmalarımız hücrelerin duyarlılığını değerlendirerek, bu beyaz madde yaralanmaların gelişiminin arkasındaki hücresel ve moleküler mekanizmasının anlaşılması üzerine odaklanmıştıroligodendrosit soy spektrum olası tedavi yaklaşımları analiz yanı sıra hakaret etmek. Malzemeler Hayvanlar ile ilgili tüm prosedürleri PHS politikası ve JHU IACUC uygundur. Tüm işlemler aseptik koşullarda sürdürmek için bir laminer akış kaputu yapılmalıdır. Genellikle diseksiyonlar yatay bir akış kaput ve dikey akış kaput in vitro çalışmalar yapılmaktadır. Tüm medya diseksiyonlar esnasında soğuk kullanılır. Çalışmamızda kullanılan fareler vahşi tip CD-1 suşu ve bir C57/BL6 arka planda bir transgenik GFP vardır. Bir CD-1 fare baraj genellikle tohum 1-2 T25 şişeler için yeterlidir 10 + fetus verir. Genellikle, iki baraj başına 1 T25 şişe içine toplanmış ve kaplama bir zaman ve fetal omurilik kurban edilir. Bir kez hücrelerin genişledi ve daha sonraki çalışmalar için in vitro karakterize edilebilir elde edilmiştir. 1. Medya ve şişeler hazırlanması CTP stok; N2 (100X; Invitrogen) ve Takviyeler Bovine Serum Albumin (BSA;% 0.5 w / v) DMEM / F12 01:01 (Invitrogen) + B27 (Invitrogen 50x): orta Diseksiyon ortam olarak kullanılır. Çözülme orta: diseksiyon orta aynıdır. Kültür ortamı: CTP stoku orta + FGF-2 (10-20 ng / ml; Invitrogen) ve heparin (1 mcg / ml; Sigma). PLL / laminin kaplı 75 cm 2 veya 25 cm 2 şişe (T75 veya T25). Daha sonra aspire 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe damıtılmış H2O içerisinde; doku kültür şişeleri (75 cm 2, Falcon) 15-20μg/ml poli-L-lisin (Sigma PLL) ile kaplandı. Şişeler PBS sonra sonra aspire ve hücreleri kaplama olmaya hazır olana kadar taze PBS veya medya eklendi, 1 saat boyunca 37 ° C'de 15-20 mcg / ml PBS içinde Laminin (Sigma) ile kaplı olan 1X yıkanır. Kaplama ardından, matara kurumasına asla izin verilmemeli, ancak 4 de PBS veya medya tutulabilir kullanımdan önce kısa dönemler için ° C. 2. Araçlar ve Diğer Material Petri: 4 başına baraj: diseksiyon için 3 Petri (75 mm), hasat omurilik toplamak için bir 20 mm çanak. Büyük makaslar (43 mm Çalışma makas, Roboz) ve baraj s karnın açılması için doku Forseps. Rahim Anatomi ve fetus (15 mm Micro Kesme Makas, Roboz) kaldırılması için küçük makas. Mikro Kesme yay makas (6 mm) fetusların omurilik incelemek. Mikro cerrahi sırasında baraj ve fetal vücut demirleme ve daha sonra bir kez maruz omurilik kaldırılması için açılı Forseps Dissecting. 40 veya kaplama öncesi hücre enkaz kaldırma için 70 mikrometre hücre süzgecinden. % 0.05 tripsin 37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış 10, bir 100X stoğu olarak hazırlanmıştır mg / ml DNAz 1 (Sigma), (1 g / ml). Hayvan cesetleri için Bio-tehlike çantası. Işlenmesi için 15 ve 50 ml'lik bir santrifüj tüpü omurilik ekstre edilmiştir. 3. Zamanlı Pr Belirlenmesiegnancy Hamile fare barajlar ya embriyonik gün E12 ya da in-house tespit fetal gelişim veya gebelik E13 teslim belirterek ticari kaynaklardan sıralanır. Kısaca, iki kadın öğleden sonra bir erkek ile birlikte konur ve birlikte bir gecede terk etti. Ertesi gün kadın vajinal bulunan mukus tıkacın varlığı gözleniyor. Mukus tıkacın hayvanlar sonradan kilo artış oranı izlemek için günlük tartılır böylece çiftleşme oluştu sadece bir göstergesidir. Mukus plug görülmektedir günlük embriyonik günde bir (E1) olarak tanımlanır. 4. Doku Derivasyon Aseptik koşullarda korumak için yatay bir akış başlık altında çalışın. % 70 etanol ile kaput ve çalışma alanının aşağı püskürtün. Otoklav aletleri veya% 70 etanol ile bolca sprey. Aletleri, medya ve kullanım için mikroskop hazırlayın. Steril Petri di içine soğuk diseksiyon orta 20 ml dökünsh. Servikal çıkık ya decapitation takiben intraperitonal (IP) tatbik kloral hidrat (500 mg / kg) ile anestezi hayvan. % 70-90 etanol (dezenfeksiyon) ile baraj karın bölgesine Sprey Büyük makas ve forseps ile karın açın. CD1 ve C57/BL6 suşlarında: Genellikle 8 ila 14 fetusun rahim içinde olacaktır. Fetusların sayısı suşu bağlıdır. Fetus kan ve doku artıkları yıkamak için temiz bir petri taze soğuk diseksiyon orta yavrular ve yer de dahil olmak üzere fare rahim ayıklayın. Uterin boynuz her fetus ayıklayın ve küçük makas kullanarak embriyonik kese ve plasenta ayırmak. Yeni bir Petri kabındaki taze diseksiyon ortama çıkarılan fetus aktarın. Diseksiyon orta metabolik aktivitesi düşük ve elde edilen hücrelerin canlılığını korumak için düşük sıcaklıkta olmalıdır. İki forseps ile şu andan itibaren Çalışma vemikro yay makas diseksiyon. Diseksiyon mikroskobu altında çalışan, mikro cerrahi makas ve omurilik maruz geri kabuğu ile spinal kord boyunca cilt kesti. Yaklaşık C1 azından mikrocerrahi makasla ve kuyruk başında spinal kord transect. , Künt forseps ile omurilik çıkarın tüm kemik ve kıkırdak çıkarıldığından emin olmak ve orta diseksiyon 3 üncü Petri transfer. Sonraki hücre kültürlerinde meningeal doku büyümesi önlemek için omurilikten mümkün olduğunca menenjlerin kadar çıkarmaya çalışın. Doğmakta olan çıkıntılı periferik sinirleri nedeniyle bu ayıklanır serebrum gelen meningeal dokusunun çıkartılması daha zordur. Bir kez meninksler kaldırılmış, 20 mm petri için omurilik aktarmak Iyice% 70-90 etanol ile alana püskürterek temizleyin. Ayrışma için aşağıdaki adımları korumak için hızlı bir şekilde yapılmalıdırspinal kord türetilmiş bir doku yüksek yaşayabilirliği. 5.. Kültür Kuruluşu Tripsin, bir 37 ° CH2, O-banyosu içinde, en azından 30 dakika süreyle ön ısıtılmış edilmelidir. Uygun bir kısım sıcaklık dalgalanmalarına stokunun maruz azaltmak için stok çıkarılmalıdır. 10ml önceden ısıtılmış tripsin (% 0.05; Kalite Biologicals) içeren 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne hasat omurilik aktarılır ve 100 ul DNAz (10 mg / ml) ve kısa bir süre için öğütmek. 37 inkübe ° 10 dakika CH 2 O-banyo. Ezip toz haline getirmek ve başka bir 10 dakika süreyle inkübe edilir. 5 ml CTP ortamı (yukarıda tanımlandığı gibi) ve 1000 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüj ekleyin. 10 ml CTP orta süpernatan ve Pastör pipetiyle pelet aspire ve DNAz-1 (10 mg / ml; Sigma) ekleyin. 37 inkübe ° 10 dakika CH 2 O-banyo. 1000 RPM az 5 dakika santrifüjleyin ve supernatant aspire. Fre ile Pastör pipetiyle pelet40 ile sh CTP orta ardından filtre enkaz – 70 mikron hücre süzgecinden. PLL / laminin kaplı 25 cm 2 şişe (T25) ve 37 inkübe ° C,% 95 nem ve% 5 CO 2 Plate. % 100 medya gününü takip eden on değiştirin. Bu noktada, GRP bağlı ve süreçleri uzanan başladı. 6. CTP Nüfus Immunopanning Matara kadar PLL / laminin kaplı şişelerde Plaka spinal kord dokusunda% 85-90 konfluent ya da bir hafta ilgili. Lastik bir polis memuru ile veya% 0.05 tripsin ile şişesi sıyırarak Hasat hücreleri iyice çiğnemek fakat nazikçe, 3 ml CTP orta ile 5 dakika iyice Pastör pipetiyle pelet için 1000 RPM hızında santrifüj. 3 T25 matara veya 3 ml 1 T75 şişeyi tamamen hücreleri kapak ve şişeler% 80-90 izdiham ulaşmasını sağlayacak orta uygun hacim eklemek için 1 ml her aktarın. Her gün medya değiştirin, er orta çabuk bitmesine neden varsa. Coat Bakteriyolojik Pe4 'de bir gece tri tabaklar (75 mm) °, bir anti-fare IgG antikoru ile birlikte C (Southern Biotech), 10 ug / ml PBS içerisinde. Aşırı tampon aspire ve PBS ile 3x Petri yıkayın. 5 ug / oda sıcaklığında (RT), 1 saat boyunca inkübe ve PBS ile seyreltilerek ml 'lik bir konsantrasyonda A2B5 antikoru (Millipore) eklenir. Daha sonra plakası kurumasını önlemek için CTP orta 8 ml eklemek PBS ile tekrar 3x plakaları yıkayın. Tüm hücreleri ayırmak için kauçuk bir polis memuru ile matara sıyırarak Petri ve hasat CTP hücrelerinden CTP orta 5 ml transfer Kümeleri parçalamak ve A2B5 kaplı bakteriyolojik Petri için 5ml hücre süspansiyonu aktarmak için kısaca hücre süspansiyonu öğütmek. Çalkalama olmadan, oda sıcaklığında 1 saat inkübe. 1 saat aspirat medya ve PBS ile 8x tabaklarını yıkıyorum sonra. Yavaşça sonra CTP orta uygun hacmi ile PLL / laminin kaplamalı plakalar veya balonları aktarmak 2 ml CTP medyada bir lastik polis memuru ile hücreleri kazıyın. </li> 7. Türetilmiş Hücre Dondurma ve Depolama Hücreler 2 ml% 0.05 tripsin ile% 85-90 konfluent T25 veya T75 şişesi hasat edilir. Tripsin seyreltilmiş ve inaktive 8ml CTP stoku orta ve 5 dk için 1000 RPM santrifüj edilir. T25 şişeler gelen pelet 1 ml CTP donma ortamı, (CTP stoku orta 10% (v / v) DMSO ve isteğe bağlı olarak,% 20 FBS ile desteklenmiş) içinde tekrar süspanse edilir. T75 şişelerinden alınmış daha büyük peletler iki misli seyreltilir. 1.5 hücre süspansiyonları – 3 x 10 10,11,12,13 hücre kriyojenik flakon (Nalgene) aktarılır ve ° C gece boyunca yavaş yavaş dondurma -80 az izopropanol içeren bir kriyojenik konteyner (Nalgene) geceleme saklanır. Gece donma hücreleri ardından dondurucu kutuları aktarılarak -80 az 6 ay ile 1 yıl saklanır N ° C veya daha uzun süreli (l). Çözülmüş hücreleri, genellikle PLL / laminin kaplama kalitesine bağlı olarak büyük ölçüde uygun bir% 60-80 vardır. </ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar CO 2, çünkü cenin ve sonuçta elde edilen hücre canlılığı üzerindeki olası aşağı etkisi hayvan anestezi için kullanılmaz. Ayrıca, tamamen türev işlem sırasında omurilikten meninksler çıkarmak çok zor olacak ama CTP orta ve immunopanning kombinasyonu bu hızlı büyüyen hücreleri ortadan kaldıracaktır. Aynı şekilde, tüm spinal kord onun ventral spinal kord menşeli ve dorsal 20 geçiş nedeniyle CTP nüfusun daha büyük bir ventral konsantrasyonu rağmen hasat edilir. Ancak CTP orta CTP fenotip için seçer ve bu nüfusun A2B5 immunopanning en üst seviyeye ulaşır. Spinal kord dokular kaplama sonra, in vitro kültürler, iki ya da bölümler için bir hafta inkübe edilir. Kültüründe 2 gün sonra, farklı morfolojiye hücreleri hetero gösteren doku kültür şişeleri görülebilirnüfusun ancak CTP orta geneity CTP fenotip için seçer. Bu hücreler A2B5 bir kombinasyonu + CTP, E-NCAM + nöronal kısıtlı öncüleri (NRP) ve nestin +, A2B5-nöroepitelyal hücreleri ve muhtemelen fibronektin + meningeal hücrelerdir. Buna ek olarak, daha olgun fenotipleri başlangıç ​​heterojen havuzu (Şekil 1A) bir çok CTP zenginleştirilmiş nüfusu arttırmak için doublekortin ve nöronal soyu için Tuj1, astrositler için GFAP ve oligo soyu için PDGFaR ve GALC dahil olmak üzere mevcut ifade göstergeleri olabilir, hücreleri olabilir hücre yoğunluğu T75 şişelerde konfluense 85-90 yaklaşık% artmıştır kez A2B5 için seçim ardından E-NCAM + hücreleri + CTP nüfus seçin ve ortadan kaldırmak için çift immunopanned olabilir. Bunlar, CTP hücreleri daha sonra A2B5 immunopanning bir zenginleştirilmiş CTP nüfusu korumak için gerekli olabilir böylece oligodendrosit fenotip için seçer bir ortamda olmasına rağmen astrositler olma yetenekleri korur. Immunopanning homomüttefiki verimleri% 95 A2B5 + hücrelerine çok daha fazla verim için A2B5 konjuge manyetik bilye (Miltenyi Biotec A.Ş.) kadar% 97 bir verim sağlamak için kullanılabilir. Böyle düzenli ortam değişiklikleri gibi bakım CTP kültürlerde Teyakkuz olmayan CTP hücre tipinin çoğalması en aza indirecektir. Hatta yokluğunda BMP-4 astrositler hala bulunamadı ve boşalmış olabilir, özellikle medyanın bir astrositik fenotipi farklılaşma yol gibi görünüyor. B27 takviyesi tri-iodothyronine hormonu (T3) içerse de, bu olay meydana gelmez T3 yüksek düzeyde orta eklenir sadece, CTP nüfus oligodendrosit içine ayırt etmek için hiçbir gözlenen eğilim oldu. Olgun oligodendrosit (Şekil 1B) ile kontaminasyon için bir endişe varsa Ancak, serbest T3 B27 takviyesi ikame edilebilir. Bu CTP hücreleri kolayca 2 veya 3 kısa süreçler küçük soma kendi morfolojisi ile ancak diğer hücre tipleri mevcut olabilir, im için ekrana tespit edilebilirmunocytochemistry önceden adlı ortak gelişim ve hücre tipi özel belirteçler için yapılabilir. Yaygın nöroepitelyal (NEP) ve CTP veya NRP ya haline yeteneğine sahiptirler A2B5-hücrelerinin, küçük bir kalıcı nüfusu olacaktır. Neyse ki, artık hücreleri orta CTP fenotip için seçecektir olasılığı daha düşüktür CTP ortamda tutulur. Şekil 1. A) heterojen morfoloji Kaplama omurilikte hücreler kültürde 2 gün sonra görülür. B) Immunopanning başlangıç ​​heterojen havuzundan çok GRP zenginleştirilmiş nüfus en üst düzeye çıkarır.