Derivación de los precursores gliales restringidas de los ratones E13

Introducción En este protocolo se muestra cómo extraer, seleccionar y placa de precursores gliales restringidas (GRP), las células de la médula espinal de E13 fetos de ratones. Estas células son precursores de los primeros dentro de los linajes de células oligodendrocíticos y los astrocitos y se definen por su expresión de A2B5. En el medio de GRP suplementado con FGF-2, los GRPs A2B5 + comenzará expresar la temprana oligodendrocíticos linaje marcadores PDGFαR y 1,2 NG2. Estas células del linaje de oligodendrocitos pasar a través de una serie de distintas etapas fenotípicos, cada uno de ellos caracterizado por cambios morfológicos, así como la expresión de marcadores específicos a las etapas de desarrollo. Estas células precursoras se está estudiando actualmente como una fuente potencial de células basadas en enfoques terapéuticos en los trastornos de la materia blanca del sistema central nervioso, incluyendo la esclerosis múltiple, leucodistrofias y la leucomalacia periventricular (LPV) 3,4,5,6 </sa>. Los estudios que utilizan cerebro humano derivado precursores de oligodendrocitos linaje han informado remielinización éxito en el cerebro de la modelo shiverer dysmyelination ratón así como en desmielinizadas modelos de médula espinal de roedores 6,7,8,9. Estas células precursoras gliales también se han utilizado en estudios de otros modelos de la sustancia blanca de enfermedades tales como la lesión de la médula espinal y la esclerosis lateral amiotrófica 10,11,12,13. Nuestro laboratorio ha desarrollado un postnatal temprano hipoxia-isquemia modelo de ratón con el que están evaluando la eficacia de estas células derivadas de la médula espinal GRP como un enfoque restaurativo en el LPV, la principal causa de la parálisis cerebral 14,15,16. También hay un cerebro de roedores derivado modelo OPC que ha sido ampliamente utilizado para el estudio de lesiones sustancia blanca ya que las células GRP tienen una tendencia a diferenciarse en la vía astrocítico 17. El fenotipo OPC ya ha entrado en la vía linaje de los oligodendrocitos, un fenómeno que parece irreversible. Sin embargo, estamos interesados ​​en evaluar la respuesta de un espectro más amplio de los progenitores de oligodendrocitos como GRPs y, posiblemente, incluso los derivados NEPs en E10.5. Por esta razón, hemos adoptado el modelo de la médula espinal deriva de GRP para nuestro trabajo. Además de la utilización de GRP para el reemplazo de células, la derivación de estas células de tipo salvaje y modelos transgénicos de roedores de las enfermedades de la sustancia blanca permite el estudio adicional en la diferenciación glial en condiciones normales y la enfermedad en una configuración en in vitro. Publicaciones previas muestran evidencia de la vulnerabilidad selectiva de las células del linaje oligodendrocíticos precursor de diversos factores de estrés externos, como la excitotoxicidad del glutamato dependiente de la maduración, el estrés oxidativo y los factores implicados en la neuroinflamación seleccionados 18,19. Nuestros estudios se han centrado en la comprensión de los mecanismos celulares y moleculares subyacentes al desarrollo de estas lesiones de sustancia blanca, la evaluación de la susceptibilidad de las células en elel espectro de linaje de los oligodendrocitos a insultar, así como el análisis de supuestos enfoques terapéuticos. Materiales Todos los procedimientos con animales se ajustan a la política de PHS y el IACUC JHU. Todos los procedimientos se debe realizar en una campana de flujo laminar a fin de mantener condiciones asépticas. Comúnmente disecciones se realizan en una campana de flujo horizontal y en el trabajo in vitro en una campana de flujo vertical. Todos los medios utilizados frío durante la disección. Los ratones usados ​​en nuestro estudio son un tipo salvaje cepa CD-1 y un transgénico GFP en un fondo C57/BL6. Un CD-1 presa de ratón produce normalmente 10 + fetos que son suficientes para semillas 1-2 T25 frascos. Típicamente, dos diques se sacrifican a la vez y fetales médulas espinales reunieron y se sembraron en un matraz T25 por presa. Una vez que las células han sido derivados que se pueden expandir y caracterizado in vitro para estudios posteriores. 1. Preparación de los Medios de Comunicación y Frascos GRPmedio se utiliza como medio de disección: DMEM / F12 1:1 (Invitrogen) + B27 (50x; Invitrogen), N2 (100x; Invitrogen), suplementos y albúmina sérica bovina (BSA; 0,5% w / v). Disociación medio: igual que el medio de la disección. El medio de cultivo: medio GRP + FGF-2 (10-20 ng / ml; Invitrogen) y heparina (1 mg / ml, Sigma). PLL / laminina revestidos o 75 cm 2 25 cm 2 frascos (T75 o T25). Matraces de cultivo de tejidos (75 cm 2, Falcon) se recubrieron con 15-20μg/ml poli-L-lisina (PLL; Sigma) en H 2 O destilada, se incuban a 37 ° C durante 1 hora luego aspirada. Los matraces se lavaron con PBS 1X reviste entonces con 15-20 mg / ml de laminina (Sigma) en PBS a 37 ° C durante 1 hora, a continuación, aspirados y fresco PBS o medios añadido hasta que las células están listas para ser chapado. Después del recubrimiento, matraces nunca debe dejarse secar pero se puede mantener en PBS o medio a 4 ° C durante períodos breves antes de su uso. 2. Instrumentos y otros material Placas de Petri: 4 por represas: 3 placas de Petri para la disección (75 mm), un plato de 20 mm para la recogida de los cordones espinales cosechados. Tijeras grandes (43 mm de operación tijera, Roboz) y pinzas de tejidos para abrir el abdomen de la presa s. Pequeña tijera para disecar el útero y la eliminación de los fetos (15 mm Micro Tijeras de disección, Roboz). Micro Tijeras de disección de primavera (6 mm) para diseccionar la médula espinal de los fetos. Micro pinza de disección en ángulo para el anclaje del cuerpo de la presa y el feto durante la cirugía y más tarde la eliminación de la médula espinal, una vez expuesta. 40 o 70 micrómetros filtro de células para eliminar los desechos celulares antes de chapado. 0,05% de tripsina precalentada a 37 ° C. 10 mg / ml de ADNasa 1 (Sigma), preparado como un stock de 100x (1 g / ml). Bio-Hazard bolsa para cadáveres de animales. 15 y 50 ml tubos de centrifugación para el procesamiento de extraer la médula espinal. 3. La determinación de temporizado Pregnancy Presas embarazadas del ratón o bien se ordenó a partir de fuentes comerciales que especifican la entrega en el día embrionario E12 o E13 del desarrollo del feto o el embarazo determina en casa. En resumen, dos mujeres se colocan junto a un macho en el final de la tarde y dejó toda la noche juntos. Al día siguiente las hembras se observó la presencia de la clavija de moco vaginal localizado. El tapón de moco es sólo una indicación de que se haya producido tan apareamiento animales se pesaron diariamente posteriormente para controlar la tasa de aumento de peso. El día se observa el tapón mucoso se define como un día embrionario (E1). 4. Derivación del tejido Trabajar bajo una campana de flujo horizontal para mantener las condiciones asépticas. Rociar abajo de la campana y el área de trabajo con etanol al 70%. Autoclave instrumentos o spray generosamente con etanol al 70%. Preparar los instrumentos, medios, y un microscopio para su uso. Verter 20 ml de medio de disección en frío en el estéril di Petrish. Anestesie animal con hidrato de cloral (500 mg / kg) administrado por vía intraperitoneal (IP), seguido por dislocación cervical o decapitación. Rocíe la zona abdominal de la madre con el 70-90% de etanol (desinfección) Abra el abdomen con tijeras grandes y pinzas. En CD1 y C57/BL6 cepas: Por lo general, los fetos de 8 a 14 será en el interior del útero. El número de fetos es dependiente de la cepa. Extraer el útero de ratón incluyendo los cachorros y el lugar en medio fresco disección en frío en una placa de Petri limpia para lavar la sangre y los restos de tejido de un feto. Extraiga cada feto desde el cuerno uterino y separarlos de la embrionaria saco y la placenta con las tijeras pequeñas. Transferencia de los fetos extraídos en el medio de disección fresco en una nueva placa de Petri. La disección medio debe estar a temperatura baja para reducir la actividad metabólica y preservar la viabilidad de las células derivadas. Trabajar a partir de ahora con dos pinzas ymicro-tijeras de disección de primavera. Trabajando bajo microscopio de disección, corte la piel a lo largo de la médula espinal con las tijeras quirúrgicas y micro exfoliación de la piel para dejar al descubierto la médula espinal. Transecto la médula espinal con las tijeras de microcirugía aproximadamente C1 y al comienzo de la cola. Retire la médula espinal con unas pinzas romas, asegurar que todos los huesos y los cartílagos se retiran y se transfiere al 3 de placa de Petri de la disección de mediano plazo. Para evitar el crecimiento excesivo de tejido meníngeo en cultivos celulares posteriores tratan de eliminar la mayor cantidad de las meninges como sea posible de la médula espinal. Debido a las nacientes sobresalen nervios periféricos esto es más difícil que la eliminación de tejido de cerebro meníngea extraído. Una vez que se han eliminado las meninges, transferir médulas espinales a 20 mm de placa de Petri Limpiar a fondo por pulverización el área con 70-90% de etanol. Los siguientes pasos para la disociación se debe hacer rápidamente para mantener launa alta viabilidad de los tejidos de la médula espinal derivada. 5. Cultura Establecimiento Tripsina debe ser pre-calentado por lo menos durante 30 minutos en un 37 ° CH 2 O-baño. Una alícuota apropiada debe ser retirado de la población para reducir la exposición de las acciones a las fluctuaciones de temperatura. Transferir los cordones espinales cosechadas a un tubo de centrífuga de 50 ml que contenía 10 ml pre-calentado tripsina (0,05%; Calidad Biologicals) y 100 l ADNasa (10 mg / ml) y se tritura brevemente. Incubar en 37 ° CH 2 O-baño durante 10 minutos. Se tritura y se incuba durante otros 10 minutos. Añadir 5 ml de medio de GRP (definido más arriba) y se centrifuga durante 5 min a 1000 rpm. Aspirar el sobrenadante y resuspender precipitado con 10 ml de medio de GRP y añadir DNAsa-1 (10 mg / ml, Sigma). Incubar en 37 ° CH 2 O-baño durante 10 minutos. Centrifugar 5 min a 1000 rpm y aspirar sobrenadante. Resuspender el pellet con frecuenciash medio de GRP entonces filtro de residuos con un 40 a 70 micras filtro de células. Placa de PLL / laminina recubierto frascos de 25 cm2 (T25) y se incuba a 37 ° C, 95% de humedad y 5% de CO 2. 100% de cambio en los medios de comunicación tras día. En este punto, GRPs han unido y comenzó a extender los procesos. 6. Immunopanning la población GRP Placa de tejido de la médula espinal en el PLL / laminina frascos revestidos hasta el frasco es 85-90% confluente o alrededor de una semana. Cosecha células por raspado matraz con un policía de caucho o con 0,05% de tripsina, se tritura bien pero con suavidad, centrifugar a 1000 rpm durante 5 min y se resuspende el sedimento a fondo con 3 ml de medio de GRP. Transferir 1 ml cada una a 3 frascos T25 o 3 ml de un frasco de T75 añade un volumen adecuado de medio para cubrir por completo las células y permitir que los matraces a alcanzar el 80-90% de confluencia. Cambiar los medios de comunicación cada dos días, antes si a medio agota rápidamente. Escudo bacteriológicas Peplatos tri (75 mm) durante la noche a 4 ° C con un anticuerpo IgM anti-ratón (Southern Biotech), 10 mg / ml en PBS. Aspire el exceso de tampón y lavar los platos de Petri 3x con PBS. Añadir A2B5 anticuerpo (Millipore) a una concentración de 5 mg / ml diluido en PBS y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). Lavar las placas 3 veces con PBS nuevo y se añaden 8 ml de medio de GRP para evitar el secado de la placa. Transferir 5 ml de medio de Fibra de placas de Petri y las células de la cosecha de PRFV por raspado de frascos con un policía de goma para extraer todas las células Triturar una breve suspensión de células para disgregar los grumos y transferir 5 ml de suspensión de células a las placas revestidas A2B5 bacteriológicos de Petri. Incubar 1 hora a temperatura ambiente sin agitación. Después de 1 hora y media de aspirado y lavado de las placas de 8x con PBS. Raspe suavemente las células con un policía de goma en 2 ml de medio GRP luego se transfieren a PLL / laminina placas recubiertas o frascos con el volumen apropiado de medio de GRP. </li> 7. Congelación y almacenamiento de las células derivadas de Las células se recolectan a partir de un 85-90% confluentes T25 o T75 frasco con 2 ml de tripsina 0,05%. La tripsina se diluye y se inactiva con medio 8ml stock de GRP y se centrifuga a 1000 rpm durante 5 min. Los pellets de T25 matraces se resuspendieron en 1 ml de medio de congelación de GRP, (GRP medio suplementado con 10% (v / v) de DMSO y, opcionalmente, FBS al 20%). Los gránulos más grandes de frascos T75 se diluyó dos veces. Las suspensiones celulares de 1,5 a 3 x 10 10,11,12,13 células se transfieren a viales criogénicos (Nalgene) y se almacenó durante la noche en un recipiente criogénico (Nalgene) que contiene isopropanol a -80 ° C a congelar lentamente durante la noche. Después de una noche congelar las células se transfieren a las cajas de congelador y almacenado de 6 meses a 1 año a -80 ° C oa más largo plazo en N (l). Las células descongeladas son típicamente 60-80% viables dependiendo en gran medida la calidad del revestimiento PLL / laminina. </ol> 8. Los resultados representativos De CO 2 no se utiliza para anestesiar al animal, debido a los posibles efectos aguas abajo de la viabilidad de los fetos y en última instancia, las células derivadas. Además, será muy difícil de eliminar totalmente las meninges de la médula espinal durante el procedimiento de derivación, pero la combinación de medio de GRP y immunopanning eliminará estas células de crecimiento rápido. Del mismo modo, la médula espinal entera se cosecha a pesar de una mayor concentración ventral de la población GRP debido a su origen en la médula espinal ventral y dorsal, la migración de 20. Sin embargo el medio GRP selecciona para el fenotipo de GRP y que la población se maximiza por A2B5 immunopanning. Después de enchapado tejidos de la médula espinal, los cultivos in vitro se incuban durante dos pasajes, o alrededor de una semana. Después de 2 días en cultivo, las células de diferentes morfologías se puede observar en los matraces de cultivo de tejidos que indican el heteroheterogeneidad de la población, pero el medio GRP selecciona para el fenotipo de GRP. Estas células son una combinación de A2B5 + GRP, E-NCAM + precursores neuronales restringidas (PNR) y nestin + y A2B5-neuroepiteliales y células, posiblemente, la fibronectina + meníngeos. Además, los fenotipos más maduras pueden estar presentes marcadores que expresan incluyendo doublecortin y Tuj1 para linaje neuronal, para GFAP astrocitos y PDGFaR y Galc para linaje oligo A fin de maximizar una población altamente enriquecido de GRP de la piscina de partida heterogéneos (Figura 1A), las células pueden ser doble immunopanned para seleccionar y eliminar los NCAM-E + células seguido por la selección para la A2B5 + población de GRP vez densidad celular ha aumentado hasta aproximadamente 85-90% de confluencia en frascos T75. Estas células GRP mantener su capacidad de convertirse en astrocitos pesar de estar en un medio que selecciona para el fenotipo oligodendrocitos tan posterior A2B5 immunopanning puede ser necesario para mantener una población altamente enriquecido de GRP. Immunopanning Generrendimientos aliado hasta un 95% A2B5 + células pero para un rendimiento aún mayor A2B5 perlas magnéticas conjugadas (Miltenyi Biotec Corp.) se puede utilizar para proporcionar un rendimiento de hasta 97%. Vigilancia en las culturas de mantenimiento GRP como cambios en los medios regulares minimizar la proliferación de tipos de células no-GRP. Incluso en ausencia de BMP-4 los astrocitos pueden todavía ser encontrados y el agotamiento de los medios de comunicación, en particular, parece inducir la diferenciación a un fenotipo astrocitos. Aunque el suplemento B27 contiene triyodotironina hormona (T3), no ha habido ninguna tendencia observada para diferenciarse en oligodendrocitos en la población de GRP, sólo cuando los niveles más altos de T3 se añaden al medio de este fenómeno se produce. Sin embargo, un T3 libre B27 suplemento puede ser sustituido si hay una preocupación por la contaminación por los oligodendrocitos maduros (Figura 1B). Estas células GRP pueden ser fácilmente identificados por su morfología de soma pequeño con 2 o 3 procesos cortos pero para la detección de otros tipos de células que pueden estar presentes, immunocytochemistry se puede realizar para los anteriormente nombrados marcadores comunes de desarrollo y tipo de células específicas. Hay normalmente será una pequeña población persistente de A2B5 células que son neuroepitelial (NEP) y capaz de convertirse en cualquiera de GRP o PNR. Afortunadamente, las células más largos se mantienen en el medio de GRP es más probable que el medio se selecciona para el fenotipo de GRP. Figura 1. Una) chapados en las células de la médula espinal de morfología heterogénea se observan después de 2 días en cultivo. B) Immunopanning maximiza una altamente enriquecido de GRP población de la piscina de partida heterogénea.