الاشتقاق من السلائف المقيد الغروية من E13 الفئران

مقدمة في هذا البروتوكول نبين كيفية استخراج، وتحديد لوحة الدبقية السلائف المقيد (GRP) خلايا من النخاع الشوكي للأجنة الفأر E13. هذه الخلايا هي السلائف في وقت مبكر داخل الخلية oligodendrocytic الأنساب ونجمي ويتم تحديدها من خلال التعبير عنها من A2B5. على المدى المتوسط ​​GRP تستكمل مع جمعية جيل المستقبل-2، سوف GRPS + A2B5 تبدأ في وقت مبكر معربا عن oligodendrocytic نسب علامات PDGFαR و 1،2 NG2. هذه الخلايا نسب oligodendrocyte تمر عبر سلسلة من مراحل المظهري متميزة، كل واحد منهم يتميز تغيرات شكلية، وكذلك التعبير عن علامات لمراحل نمو محددة. ويجري حاليا هذه الخلايا السليفة التي تجري دراستها باعتبارها مصدرا محتملا لخلية النهج المستندة العلاجية في اضطرابات في الجهاز العصبي المركزي المسألة الأبيض، بما في ذلك مرض التصلب المتعدد، leukodystrophies وتلين بيضاء الدماغ المحيطة بالبطينات (PVL) 3،4،5،6 </sيصل>. وأفادت دراسات باستخدام الدماغ البشري مستمد السلائف نسب oligodendrocyte عودة الميالين ناجحة في أدمغة خلل تخلق الميالين نموذج shiverer الماوس، وكذلك في العمود الفقري عديمة الميلين نماذج القوارض الحبل 6،7،8،9. كما تم هذه الخلايا الدبقية السلائف المستخدمة في الدراسات الأخرى بيضاء نماذج مرض المسألة مثل اصابات الحبل الشوكي والتصلب الجانبي 10،11،12،13. وقد وضعت مختبر لدينا في وقت مبكر بعد الولادة نقص الأكسجة نموذج الفأر، مع نقص التروية الذي نقوم بتقييم فعالية هذه الحبل الشوكي الخلايا المشتقة GRP كنهج التصالحية في PVL، وهو السبب الرئيسي للشلل الدماغي 14،15،16. وهناك أيضا الدماغ القوارض المستمدة OPC النموذج الذي تم استخدامه على نطاق واسع لدراسة المسألة منذ أبيض اصابة الخلايا GRP لديهم ميل إلى التفريق في المسار نجمي 17. دخلت النمط الظاهري OPC بالفعل مسار نسب oligodendrocyte، وهي الظاهرة التي يبدو irreversible. ومع ذلك، ونحن مهتمون في تقييم استجابة من مجموعة أوسع من الأسلاف oligodendrocyte بما في ذلك الهاتف المتنقل العالمي، وحتى ربما المعتمدة على قوائم مستمد في E10.5. لهذا السبب اعتمدنا في العمود الفقري نموذج الحبل GRP المستمدة لعملنا. بالإضافة إلى استخدام الهاتف المتنقل العالمي لاستبدال الخلايا، والاشتقاق من هذه الخلايا من نوع البرية ونماذج القوارض المعدلة وراثيا من الأمراض المادة البيضاء تتيح مزيدا من الدراسة إلى التمايز الدبقية في ظل ظروف طبيعية، ومرض في المختبر في الإعداد. المنشورات السابقة تظهر أدلة على التعرض الانتقائي لoligodendrocytic الخلايا السليفة نسب إلى الضغوطات الخارجية المختلفة مثل excitotoxicity نضوج الغلوتامات تعتمد، الاكسدة، وعوامل تحديد المتورطين في neuroinflammation 18،19. وقد ركزت دراستنا على فهم الآليات الخلوية والجزيئية وراء تطوير هذه الإصابات المادة البيضاء، وتقييم حساسية من الخلايا فيالطيف نسب oligodendrocyte إلى إهانة، فضلا عن تحليل النهج العلاجية المفترضة. المواد جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات تتفق مع السياسة العامة PHS وIACUC JHU. يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات في غطاء محرك السيارة تدفق رقائقي من أجل الحفاظ على ظروف معقمة. عادة يتم إجراء التشريح في غطاء تدفق الأفقي والعمل في المختبر في غطاء تدفق عمودي. تستخدم جميع وسائل الإعلام الباردة خلال التشريح. الفئران المستخدمة في دراستنا هي نوع البرية CD-1 سلالة وGFP المعدلة وراثيا في خلفية C57/BL6. واحدة CD-1 سد الماوس ينتج عادة الأجنة + 10 التي تكفي لقوارير البذور T25 1-2. عادة، يتم التضحية سدين في وقت واحد والنخاع الشوكي الجنين المجمعة ومطلي على 1 T25 قارورة في السد. مرة واحدة قد تم الحصول على الخلايا ويمكن التوسع فيها، وتميزت في المختبر لإجراء دراسات لاحقة. 1. إعداد وسائل الإعلام وقوارير GRP الأوراق الماليةويستخدم المتوسطة باعتبارها وسيلة التشريح: DMEM / F12 1:1 (إينفيتروجن) + B27 (50X؛ إينفيتروجن) N2 (100X؛ إينفيتروجن) ملاحق والأبقار مصل الزلال (جيش صرب البوسنة، 0.5٪ W / V). تفكك المتوسطة: نفس المتوسطة تشريح. ثقافة المتوسط: GRP متوسط ​​المخزون + FGF-2 (10-20 نانوغرام / مل؛ إينفيتروجن) والهيبارين (1 ميكروغرام / مل؛ سيجما). PLL / laminin مطلي 75 سم 2 أو 25 سم 2 قوارير (T75 أو T25). وقد تم طلاء قوارير زراعة الأنسجة (75 سم 2، فالكون) مع 15-20μg/ml بولي-L-يسين (PLL؛ سيجما) في 2 المقطر O H، حضنت على 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم يستنشق. تغسل القوارير 1X مع PBS مغلفة ثم مع ميكروغرام 15-20 / مل Laminin (سيغما) في برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، ثم يستنشق وبرنامج تلفزيوني جديد أو وسائل الإعلام واضاف حتى الخلايا على استعداد ليكون مطلي. بعد طلاء، لا ينبغي أبدا أن يسمح القوارير حتى يجف ولكن يمكن الاحتفاظ بها في برنامج تلفزيوني أو وسائل الإعلام في 4 درجات مئوية لفترات وجيزة قبل الاستخدام. 2. الصكوك وM أخرىaterial أطباق بتري: 4 في السد: 3 أطباق بتري لتشريح (75 ملم)، طبق 20 ملم لجمع الحبال التي تحصد في العمود الفقري. مقص كبير (43 مقص التشغيل مم، Roboz) والملقط الأنسجة لفتح البطن السد ق. مقص صغير لتشريح الرحم وإزالة الأجنة (15 مم مايكرو مقص تشريح، Roboz). الدقيقة مقص تشريح ربيع (6 مم) لتشريح النخاع الشوكي للأجنة. الجزئي تشريح الملقط الزاوية لترسيخ الجسم السد والجنين خلال عملية جراحية في وقت لاحق، وإزالة الحبل الشوكي يتعرض مرة واحدة. 40 أو 70 مصفاة خلية ميكرومتر لازالة الحطام الخلية قبل الطلاء. prewarmed التربسين 0.05٪ لتصل إلى 37 درجة مئوية. 10 ملغ / مل الدناز 1 (سيغما)، كما أعدت مخزونا 100X (1 جم / مل). الحيوي خطر كيس للجثث الحيوانات. 15 و 50 أنابيب الطرد المركزي لمعالجة مل استخراج النخاع الشوكي. 3. تحديد موقوت العلاقات العامةegnancy تنظم إما السدود فأر حامل من مصادر تجارية تحديد التسليم في يوم الجنينية E12 أو E13 من نمو الجنين أو الحمل تحدد في المنزل. لفترة وجيزة، يتم وضع أنثيين مع واحد من الرجال في وقت متأخر بعد الظهر، وغادر ليلة معا. في اليوم التالي لوحظ أن الإناث لوجود سد المخاط الموجود عن طريق المهبل. المكونات مخاط ليست سوى مؤشر على أن التزاوج وقعت في وقت لاحق حتى يتم وزن الحيوان يوميا لرصد معدل زيادة الوزن. ويعرف هذا اليوم هو لاحظ سد المخاط كما الجنينية يوم واحد (E1). 4. الأنسجة الاشتقاق تعمل تحت غطاء تدفق أفقي للحفاظ على ظروف معقمة. رش أسفل غطاء محرك السيارة، ومنطقة العمل مع الإيثانول بنسبة 70٪. أدوات التعقيم أو رش تحرري مع الايثانول 70٪. إعداد الأدوات ووسائل الإعلام، ومجهر للاستخدام. صب 20 مل من المتوسط ​​تشريح الباردة في دي بتري معقمةش. تخدير الحيوانات مع هيدرات الكلورال (500 ملغ / كلغ) تدار intraperitoneally (IP)، يليه سرطان عنق الرحم أو خلع قطع الرأس. رش منطقة البطن من السد مع الايثانول 70-90٪ (التطهير) فتح البطن مع مقص كبير وملقط. في CD1 وC57/BL6 سلالات: عادة 8-14 الأجنة سيكون داخل الرحم. عدد الأجنة هو سلالة التابعة. استخراج الرحم الفأرة بما في ذلك الصغار ومكان جديد في المتوسط ​​تشريح الباردة في طبق بيتري نظيفة لغسل الدم وحطام الأنسجة من الجنين. استخراج كل الجنين من الرحم والبوق تفصلهم عن كيس الجنين والمشيمة باستخدام مقص صغير. نقل الأجنة المستخرجة إلى المتوسطة تشريح جديد في طبق بيتري جديد. وينبغي أن يكون متوسط ​​تشريح في درجات الحرارة المنخفضة إلى انخفاض نشاط التمثيل الغذائي والحفاظ على سلامة الخلايا المشتقة. العمل من الآن فصاعدا مع اثنين من الملقط والجزئي تشريح الربيع مقص. تعمل تحت مجهر تشريح، وقطع الجلد على طول الحبل الشوكي مع مقص الجراحية الدقيقة والجلد قشر مرة أخرى إلى فضح الحبل الشوكي. القطع في الحبل الشوكي مع مقص المجهرية في حوالي C1 و في بداية الذيل. إزالة النخاع الشوكي مع ملقط كليل، وضمان تتم إزالة كافة العظام والغضاريف ونقل إلى 3 طبق بيتري الثالث من تشريح المتوسط. لمنع فرط نمو النسيج السحائي في مزارع الخلايا لاحقا في محاولة لإزالة أكبر قدر من السحايا ممكن من الحبل الشوكي. بسبب الأعصاب الطرفية الناشئة جاحظ هذا هو أكثر صعوبة من إزالة أنسجة المخ السحائي من استخراجها. مرة واحدة قد أزيلت السحايا، نقل النخاع الشوكي إلى 20 مم طبق بتري تنظيف عن طريق الرش بدقة في مجال الايثانول مع 70-90٪. وينبغي القيام بالخطوات التالية لتفكك بسرعة للحفاظ على1 قابلية عالية من الأنسجة المشتقة من النخاع الشوكي. 5. ثقافة المؤسسة وينبغي أن التربسين مسبقا تحسنت مدة لا تقل عن 30 دقيقة في 37 درجة CH 2 O-حمام. وينبغي استبعاد اي قسامة المناسبة من الأسهم للحد من التعرض للسهم إلى تقلبات درجات الحرارة. نقل الحبال التي تحصد في العمود الفقري لأنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على 50 مل 10ML قبل حرارة التربسين (0.05٪، ونوعية المواد البيولوجية) و 100 الدناز ميكروليتر (10 ملغ / مل)، وسحق لفترة وجيزة. في احتضان 37 درجة CH 2 O-حمام لمدة 10 دقائق. يسحن واحتضان لمدة 10 دقيقة. إضافة 5 مل GRP المتوسطة (المحددة أعلاه)، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1000 دورة في الدقيقة. نضح وطاف بيليه resuspend مع 10 مل المتوسطة GRP وإضافة الدناز-1 (10 ملغ / مل؛ سيجما). في احتضان 37 درجة CH 2 O-حمام لمدة 10 دقائق. منبذة 5 دقائق في 1000 دورة في الدقيقة، ونضح طاف. Resuspend بيليه مع الصحائفش GRP المتوسطة الحطام ثم فلتر مع 40-70 مصفاة خلية ميكرون. لوحة على PLL / laminin مطلي 25 سم 2 قوارير (T25)، واحتضان عند 37 درجة مئوية والرطوبة 95٪ و 5٪ CO 2. وسائل الإعلام 100٪ تغيير في اليوم التالي. عند هذه النقطة، قد تعلق الهاتف المتنقل العالمي، وبدأت عمليات توسيع. 6. Immunopanning للسكان GRP نسيج لوحة الحبل الشوكي في PLL / laminin قوارير المغلفة حتى قارورة هو 85-90٪ متموجة أو نحو أسبوع. حصاد الخلايا عن طريق كشط قارورة مع شرطي المطاط أو مع التربسين 0.05٪، يسحن جيدا ولكن بلطف، الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق وبدقة بيليه resuspend مع 3 المتوسطة GRP مل. نقل 1 مل كل لقوارير T25 3 أو 3 مل إلى 1 T75 قارورة إضافة وحدات مناسبة من المتوسط ​​لتغطية تماما الخلايا وتسمح للقوارير للوصول إلى نقطة التقاء 80-90٪. تغيير وسائل الاعلام كل يوم، عاجلا إذا المتوسطة يستنفد بسرعة. معطف البكتريولوجية بيثلاثي أطباق (75 ملم) بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع الضد IgM المضادة للماوس (جنوب في مجال التكنولوجيا الحيوية)، و 10 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني. نضح المخزن المؤقت الزائدة وغسل الأطباق بيتري 3x مع برنامج تلفزيوني. إضافة A2B5 الأجسام المضادة (ميليبور) بتركيز من 5 ميكروغرام / مل مخففة في برنامج تلفزيوني والحضانة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT). غسل الأطباق 3X مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني ثم تضاف 8 مل من المتوسط ​​GRP لمنع جفاف لوحة. نقل 5 مل من المتوسط ​​GRP من أطباق بتري والخلايا GRP الحصاد عن طريق كشط قوارير مع شرطي المطاط لفصل كل الخلايا يسحن تعليق خلية لفترة وجيزة لتفتيت كتل ونقل 5ml تعليق الخلية إلى A2B5 المغلفة أطباق بتري الجرثومية. احتضان 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة دون أن تهتز. بعد 1 وسائل الاعلام نضح الموارد البشرية وألواح غسيل 8X مع برنامج تلفزيوني. كشط بلطف خلايا مع شرطي المطاط في 2 وسائل الاعلام GRP مل ثم نقل إلى PLL / laminin لوحات مطلية أو قوارير مع حجم مناسب لمتوسط ​​GRP. </lI> 7. تجميد وتخزين الخلايا المشتقة ويتم حصاد الخلايا من قارورة T25 أو T75 متكدسة 85-90٪ مع التربسين 2 مل 0.05٪. يتم تخفيف التربسين والمعطل مع متوسط ​​8ml الأسهم GRP وبالطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. ومعلق الكريات T25 من القوارير في 1 مل المتوسطة تجميد GRP، (GRP المتوسطة الأوراق المالية تستكمل مع 10٪ (V / V) DMSO واختياريا، FBS 20٪). مخففة أكبر من الكريات T75 قوارير شقين. يتم نقل 3 × 10 10،11،12،13 الخلايا لقوارير المبردة (Nalgene) وتخزينها بين عشية وضحاها في وعاء المبردة (Nalgene) التي تحتوي على الأيزوبروبانول -80 درجة مئوية لتجميد ببطء بين عشية وضحاها – تعليق خلية من 1.5. بعد تجميد الخلايا بين عشية وضحاها يتم تحويلها إلى مربعات الثلاجة وتخزينها 6 أشهر إلى سنة 1 في -80 درجة مئوية أو المدى الطويل في N (ل). إذابة الخلايا وعادة ما تكون قابلة للحياة 60-80٪ اعتمادا إلى حد كبير على نوعية الطلاء PLL / laminin. </ol> 8. ممثل النتائج لا يتم استخدام ثاني أكسيد الكربون 2 لالتخدير الحيوان بسبب تأثير المصب المحتملة على سلامة الأجنة والخلايا المشتقة في نهاية المطاف. وعلاوة على ذلك، سيكون من الصعب جدا لإزالة تماما السحايا من الحبل الشوكي أثناء إجراء الاشتقاق لكن الجمع بين المتوسطة وGRP immunopanning سيقضي على هذه الخلايا سريعة النمو. وبالمثل، يتم حصاد الحبل الشوكي بأكمله على الرغم من تركيز أكبر بطني من السكان GRP بسبب تنشأ في النخاع الشوكي بطني والهجرة ظهريا 20. لكن على المديين المتوسط ​​GRP يختار النمط الظاهري للGRP وإلى أقصى حد ممكن أن عدد السكان من قبل A2B5 immunopanning. بعد الطلاء أنسجة الحبل الشوكي، وحضنت والثقافات في المختبر لاثنين من الممرات أو نحو أسبوع. بعد 2 أيام في الثقافة، يمكن أن يلاحظ خلايا morphologies مختلفة في قوارير زراعة الأنسجة مما يدل على مغايرgeneity من السكان ولكن على المديين المتوسط ​​GRP يختار النمط الظاهري للGRP. هذه الخلايا هي مزيج من A2B5 + GRP، E-NCAM + السلائف المقيد العصبية (المفدال) وnestin +، A2B5-خلايا عصبية ظهارية وخلايا فبرونيكتين ربما + السحائي. وبالإضافة إلى ذلك، الظواهر الأكثر نضجا قد يكون موجودا علامات الإعراب بما في ذلك doublecortin وTuj1 لنسب الخلايا العصبية، GFAP لالنجمية وPDGFaR وGalC لنسب بنسبة ضئيلة من أجل تحقيق أقصى قدر عدد سكانها عالي التخصيب GRP من تجمع غير المتجانسة انطلاق (الشكل 1A)، يمكن للخلايا أن تكون مزدوجة immunopanned لتحديد والقضاء على E-NCAM + الخلايا تليها اختيار لA2B5 + GRP السكان مرة واحدة كثافة الخلية قد زاد الى نحو 85-90٪ confluency T75 في قوارير. هذه الخلايا GRP الحفاظ على قدرتها على أن تصبح الخلايا النجمية على الرغم من كونها وسيلة في أن يختار لذلك النمط الظاهري oligodendrocyte اللاحقة A2B5 immunopanning قد يكون ضروريا للحفاظ على عدد السكان GRP عالي التخصيب. Immunopanning خينيرغلة حليف تصل إلى 95٪ A2B5 + الخلايا ولكن لمحصول أكبر حتى يمكن استخدام A2B5 حبات مغناطيسية مترافق (Miltenyi شركة بيوتيك) لتوفير العائد لمدة تصل إلى 97٪. واليقظة في الثقافات GRP صيانة مثل التغيرات وسائل الإعلام العادية تقليل انتشار أنواع الخلايا غير GRP. حتى في غياب BMP-4 ربما لا يزال الخلايا النجمية يمكن العثور على وسائل الاعلام المنضب على وجه الخصوص يبدو للحث على التمايز إلى النمط الظاهري نجمي. على الرغم من أن ملحق B27 تحتوي على ثلاثي iodothyronine هرمون (T3)، لم يكن هناك أي اتجاه لوحظ أن تفرق في oligodendrocytes في السكان GRP، فقط عندما يتم إضافة مستويات أعلى من T3 على المدى المتوسط ​​لا تحدث هذه الظاهرة. ومع ذلك، يمكن أن تكون بديلا 1 T3 الحرة B27 الملحق إذا كان هناك مصدر قلق للتلوث من قبل oligodendrocytes الناضجة (الشكل 1B). ويمكن هذه الخلايا GRP تحديدها بسهولة من قبل التشكل بهم من سوما صغير مع 2 أو 3 عمليات قصيرة ولكن للكشف عن أنواع الخلايا الأخرى التي قد تكون موجودة، والتراسل الفوريلا يمكن أن يؤديها munocytochemistry للمشترك الذي كان يسمى سابقا علامات نوع التنموية وخلية محددة. لن يكون هناك عادة عدد قليل من السكان المستمرة لخلايا عصبية ظهارية A2B5 التي هي (السياسة الاقتصادية الجديدة)، وقادرة على أن تصبح إما GRP أو المفدال. لحسن الحظ، يتم الاحتفاظ أطول الخلايا في المتوسط ​​GRP والأرجح أن متوسط ​​سيتم تحديد النمط الظاهري للGRP. الشكل 1. أ) لوحظ مطلي خلايا النخاع الشوكي من التشكل غير متجانسة بعد 2 أيام في الثقافة. ب) Immunopanning يزيد GRP-1 عالي التخصيب من سكان تجمع غير المتجانسة انطلاق.