Afleiding van gliale Beperkte Voorlopers van de E13 muizen

Introductie In dit protocol laten we zien hoe te winnen, te selecteren en de plaat gliale beperkte precursor (GRP) cellen van het ruggenmerg van de E13 muis foetussen. Deze cellen zijn vroege voorlopers binnen de oligodendrocytic en astrocytaire cellijnen en wordt bepaald door hun uitdrukking van A2B5. In het GRP medium aangevuld met FGF-2, zal de A2B5 + GRP's beginnen de uiting van de vroege oligodendrocytic lijn markers PDGFαR en NG2 1,2. Deze oligodendroglia lijn cellen langs een reeks afzonderlijke fenotypische fasen, elk gekenmerkt door morfologie, en expressie van markers specifieke ontwikkelingsstadia. Deze voorloper cellen worden momenteel bestudeerd als een potentiële bron voor cel-gebaseerde therapeutische benaderingen in aandoeningen van het centrale zenuwstelsel witte stof, met inbegrip van multiple sclerose, leukodystrophies en periventriculaire leukomalacie (PVL) 3,4,5,6 </sup>. Studies met menselijke hersenen afgeleide oligodendrocyt lijn voorlopers hebben gemeld succesvol remyelinisatie in hersenen van de muis shiverer dysmyelination model als in gedemyeliniseerde ruggenmerg knaagdiermodellen 6,7,8,9. Deze gliale voorloper cellen zijn ook gebruikt in studies van andere wittestofziekte modellen zoals ruggenmergletsel en amyotrofische laterale sclerose 10,11,12,13. Ons laboratorium heeft een vroege postnatale hypoxie-ischemie muismodel waarmee we het evalueren van de werkzaamheid van deze ruggenmerg afgeleid GRP cellen als een restauratieve aanpak in PVL, de belangrijkste oorzaak van hersenverlamming 14,15,16. Er is ook een knaagdier hersenen afgeleide OPC model dat op grote schaal gebruikt voor het bestuderen witte stof schade omdat de polyester cellen neiging om te differentiëren in de astrocytic route 17. De OPC-fenotype is al ging de oligodendrocyt lijn weg, een fenomeen dat lijkt irreversible. We zijn echter geïnteresseerd zijn in de beoordeling van de respons van een breder spectrum van oligodendrocyt voorlopercellen ook GRP's en misschien zelfs de NEP's afgeleid op E10.5. Om deze reden hebben we aangenomen het ruggenmerg afgeleid GRP-model voor ons werk. Naast het gebruik van GRP voor celvervanging de afleiding van deze cellen van wildtype en transgene diermodellen van ziekte kan witte stof nader onderzoek naar gliacellen differentiatie onder normale en aandoeningen in een in vitro omgeving. Vorige publicaties aantonen van selectieve kwetsbaarheid van oligodendrocytic lijn voorloper cellen aan verschillende externe stressoren, zoals rijping afhankelijk van glutamaat excitotoxiciteit, oxidatieve stress, en selecteer factoren betrokken in ontstekingsprocessen 18,19. Onze studies hebben zich gericht op het begrijpen van de cellulaire en moleculaire mechanismen achter de ontwikkeling van deze witte stof letsels, het evalueren van de gevoeligheid van cellen inde oligodendrocyt afstamming spectrum zo goed beledigen als het analyseren van vermeende therapeutische benaderingen. Materialen Alle procedures met betrekking tot dieren voldoen aan PHS beleid en de JHU IACUC. Alle procedures worden uitgevoerd in een laminaire stroming kap om aseptische omstandigheden. Gewoonlijk secties worden uitgevoerd in een horizontale stroming kap en in vitro onderzoek in een verticale kap. Alle media dat koud wordt gebruikt tijdens de dissecties. De muizen die in deze studie zijn wildtype CD-1-stam en transgene GFP in een C57/BL6 achtergrond. Een CD-1 muis dam levert meestal 10 + foetussen die voldoende zijn om zaad 1-2 T25 flessen. Meestal worden twee dammen opgeofferd op een moment en foetale ruggenmerg samengevoegd en uitgeplaat in een T25 fles per dam. Wanneer cellen afgeleid kunnen worden uitgebreid en kenmerk vitro voor verdere studies. 1. Voorbereiding van de media en Kolven GRP voorraadmedium wordt gebruikt als Dissection medium: DMEM / F12 1:1 (Invitrogen) + B27 (50x, Invitrogen) N2 (100x, Invitrogen) en aanvullingen Bovine Serum Albumine (BSA, 0,5% w / v). Dissociatie medium: hetzelfde als dissectie medium. Cultuur medium: GRP voorraad medium + FGF-2 (10-20 ng / ml; Invitrogen) en heparine (1 pg / ml, Sigma). PLL / laminine gecoat 75 cm 2 of 25 cm 2 flessen (T75 of T25). Weefselkweekflessen (75 cm2, Falcon) werden gecoat met 15-20μg/ml Poly-L-lysine (PLL, Sigma) in gedestilleerd H2O, geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 1 uur dan afgezogen. Flessen worden gewassen met PBS 1X vervolgens bekleed met 15-20 pg / ml laminine (Sigma) in PBS bij 37 ° C gedurende 1 uur, vervolgens afgezogen en verse PBS of media toegevoegd totdat cellen bereid worden uitgeplaat. Na coating moet kolven nooit drogen, maar kan worden gehouden in PBS of media bij 4 ° C voor korte perioden voor gebruik. 2. Instrumenten en Other Materiaal Petrischalen: 4 per dam: 3 petrischalen voor dissectie (75 mm), een 20 mm schaal voor het verzamelen van de geoogste ruggenmerg. Grote schaar (43 mm Operating schaar, Roboz) en weefsel tang voor het openen van de dam s buik. Kleine schaar voor het ontleden van de baarmoeder en het verwijderen van de foetussen (15 mm Micro ontleden van Schaar, Roboz). Micro ontleden van de lente schaar (6 mm) aan het ruggenmerg van de foetussen te ontleden. Micro ontleden gebogen tang voor het verankeren van de dam en foetale lichaam tijdens de operatie en later verwijderen van het ruggenmerg een keer blootgesteld. 40 of 70 micrometer cel zeef voor het verwijderen van celresten voor plating. 0,05% Trypsine voorverwarmd tot 37 ° C. 10 mg / ml DNase 1 (Sigma), bereid zoals 100x voorraad (1 g / ml). Bio-hazard tas voor dode dieren. 15 en 50 ml centrifugebuizen voor de verwerking van gewonnen ruggenmerg. 3. Het bepalen van Timed Pregnancy Zwangere muis dammen zijn ofwel besteld uit commerciële bronnen met vermelding van levering op embryonale dag E12 of E13 van de ontwikkeling van de foetus of de zwangerschap bepaald in huis. In het kort worden twee vrouwtjes geplaatst samen met een man in de late namiddag en liet 's nachts samen. De volgende dag vrouwtjes waargenomen in aanwezigheid van vaginaal gelegen slijmprop. De slijmprop is slechts een indicatie dat de paring zich zo dieren vervolgens worden gewogen dagelijks aan snelheid van gewichtstoename te controleren. De dag dat de slijmprop wordt waargenomen wordt gedefinieerd als embryonale dag een (E1). 4. Tissue Afleiding Werken onder een horizontale stroming kap om aseptische omstandigheden te behouden. Spuit het kap-en werkgebied met 70% ethanol. Autoclaaf instrumenten of spray royaal met 70% ethanol. Bereid instrumenten, media, en microscoop voor gebruik. Breng 20 ml koud dissectie medium in steriele Petri dish. Verdoven dier met chloorhydraat (500 mg / kg) intraperitoneaal toegediend (IP), gevolgd door cervicale dislocatie en onthoofd. Spuit de buikstreek van de dam met 70-90% ethanol (desinfectie) Open buik met grote schaar en tang. In CD1 en C57/BL6 stammen: Meestal 8 tot 14 foetussen zal zijn in de baarmoeder. Het aantal foetussen is stam afhankelijk. Pak de muis baarmoeder met inbegrip van de pups en doe dit in vers, koud dissectie medium in een schone petrischaal met bloed en weefsel puin te wassen van de foetus. Uittreksel elke foetus uit de baarmoeder hoorn en scheiden ze van de embryonale zak en de placenta met de kleine schaar. Breng de gewonnen foetussen in verse dissectie medium in een nieuw petrischaal. Dissection medium moet bij lage temperatuur van de metabole activiteit te verlagen en het behoud van leefbaarheid van afgeleide cellen. Werk van nu af aan met twee tangen enmicro ontleden van de lente-schaar. Werken onder dissectie microscoop, knip de huid langs het ruggenmerg met de micro-chirurgische schaar en pel de huid terug naar het ruggenmerg bloot te leggen. Doorsnijden het ruggenmerg de microchirurgische schaar ongeveer C1 en het begin van de staart. Verwijder het ruggenmerg met stompe tang, moeten alle bot en kraakbeen worden verwijderd en over te brengen naar 3 e petrischaal van ontleden medium. Om overmatige groei van meningeale weefsel in de daaropvolgende celculturen te voorkomen proberen om zoveel mogelijk van de hersenvliezen als mogelijk te verwijderen van het ruggenmerg. Als gevolg van de opkomende uitstekende perifere zenuwen is dit moeilijker dan het verwijderen van meningeale weefsel uit gehaald hersenen. Zodra hersenvliezen zijn verwijderd, over te dragen ruggenmerg tot 20 mm petrischaal Opruimen door grondig spuiten met 70-90% ethanol. De volgende stappen voor dissociatie snel worden uitgevoerd handhavenhoge levensvatbaarheid van de afgeleide ruggenmergweefsel. 5. Cultuur Oprichting Trypsine worden voorverwarmd ten minste 30 minuten in een 37 ° CH2 O-bad. Een passende hoeveelheid moet worden verwijderd uit de bouillon aan de blootstelling van voorraad om temperatuurschommelingen te verminderen. Breng de geoogste ruggenmerg een 50 ml centrifugebuis met 10 ml voorverwarmde trypsine (0,05% kwaliteit Biologicals) en 100 ul DNAse (10 mg / ml) en vermalen kort. Incubeer in 37 ° CH 2 O-bad gedurende 10 minuten. Vermaal en incubeer gedurende nog eens 10 minuten. 5 ml GRP medium (hierboven beschreven) en gecentrifugeerd gedurende 5 min bij 1000 rpm. Zuig supernatant en pellet hersuspenderen met 10 ml medium polyester en voeg DNAse-1 (10 mg / ml; Sigma). Incubeer in 37 ° CH 2 O-bad gedurende 10 minuten. Centrifugeer 5 min bij 1000 rpm en zuig supernatant. Resuspendeer de cellen met een frequentiesh GRP medium dan filter vuil met een 40 – 70 pm cel zeef. Plaat PLL / laminine bekleed 25 cm2 flessen (T25) en incuberen bij 37 ° C, 95% vochtigheid en 5% CO2. 100% media te wijzigen op de volgende dag. Op dit moment hebben GRP's bevestigd en begon uitbreiding van processen. 6. Immunopanning de GRP Bevolking Plaat ruggenmerg weefsel in PLL / laminine gecoat kolven totdat fles is 85-90% samenvloeiing of ongeveer een week. Oogst cellen schrapen kolf met een rubberen spatel of 0,05% trypsine, grondig vermalen maar voorzichtig gecentrifugeerd op 1000 rpm gedurende 5 minuten en grondig Resuspendeer met 3 ml GRP medium. Breng 1 ml per m 3 T25 flessen of 3 ml tot 1 T75 fles toe te voegen voldoende hoeveelheden van medium volledig te bedekken cellen en flacons tot 80-90% confluentie bereiken mogelijk te maken. Wijzig de media om de andere dag, eerder als medium put snel. Coat Bacteriologische Petri schotels (75 mm) gedurende een nacht bij 4 ° C met een anti-muis IgM antilichaam (Southern Biotech), 10 pg / ml in PBS. Zuig de overtollige buffer en was de petrischalen 3x met PBS. Voeg A2B5 antilichaam (Millipore) bij een concentratie van 5 pg / ml verdund in PBS en geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT). Was de plaatjes weer 3x met PBS en voeg dan 8 ml GRP medium om uitdroging te voorkomen van de plaat. 5 ml van polyester medium uit Petrischalen oogst GRP cellen schrapen flessen met een rubberen spatel alle cellen los Kort Vermaal celsuspensie te breken klonten en 5 ml celsuspensie over te dragen aan de A2B5 gecoate bacteriologische petrischalen. Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur zonder schudden. Na 1 uur aspiraat media en wassen platen 8x met PBS. Voorzichtig schrapen cellen met een rubberen spatel in 2 ml GRP media dan naar PLL / laminine gecoate platen of flesjes over te dragen met de juiste volume van GRP medium. </li> 7. Invriezen en opslag van afgeleide cellen Cellen worden geoogst van een 85-90% samenvloeiing T25 of T75 kolf met 2 ml 0,05% trypsine. Trypsine verdund en onwerkzaam 8 ml polyester stock medium en gecentrifugeerd bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. Pellets van T25 flessen worden opnieuw gesuspendeerd in 1 ml medium polyester invriezen (GRP stock medium aangevuld met 10% (v / v) DMSO en eventueel, 20% FBS). De grotere pellets van T75 kolven worden verdund tweeledig. Celsuspensies van 1,5 – 3 x 10 10,11,12,13 cellen overgebracht naar cryogene flacons (Nalgene) en nacht in een cryogene container (Nalgene) met isopropanol bij -80 ° C langzaam invriezen nacht. Na overnacht invriezen cellen overgebracht naar vriezer dozen bewaard 6 maanden 1 jaar bij -80 ° C of langere tijd in N (l). Ontdooide cellen typisch 60-80% haalbaar grotendeels afhankelijk van de kwaliteit van de PLL / laminine coating. </ol> 8. Representatieve resultaten CO 2 niet wordt gebruikt verlamming het dier wegens de mogelijke invloed waren op de levensvatbaarheid van de foetussen en uiteindelijk de afgeleide cellen. Bovendien zal het erg moeilijk zijn om volledig de meningen van het ruggenmerg te verwijderen tijdens de afleiding procedure, maar de combinatie van GRP medium en immunopanning een einde zal maken van deze snel groeiende cellen. Evenzo wordt de gehele ruggenmerg geoogst ondanks een hogere concentratie van de ventrale GRP populatie als gevolg van de uit de ventrale ruggenmerg migreren dorsaal 20. Echter, de GRP medium kiest voor de GRP fenotype en dat de bevolking wordt gemaximaliseerd door A2B5 immunopanning. Na plateren ruggenmergweefsel, worden de in vitro kweken geïncubeerd twee passages of een week. Na 2 dagen kweken kan cellen van verschillende morfologie worden waargenomen in de weefselkweekflessen waarin de heterodoorgaand identieke optiek de bevolking, maar de GRP medium kiest voor de GRP fenotype. Deze cellen zijn een combinatie van A2B5 + GRP, E-NCAM + neuronale beperkte precursoren (NHP) en Nestin +, A2B5-neuro-epitheliale cellen en mogelijk fibronectine + meningeale cellen. Daarnaast is meer volwassen fenotypen aanwezig kunnen zijn uitdrukken markers waaronder doublecortin en Tuj1 voor neuronale afkomst, GFAP voor astrocyten en PDGFaR en GalC voor oligo lijn Met het oog op een zeer GRP verrijkt bevolking te maximaliseren van de start heterogene pool (Figuur 1A), kunnen cellen zijn dubbel immunopanned te selecteren en te verwijderen van de E-NCAM + cellen, gevolgd door de selectie voor de A2B5 + GRP bevolking een keer celdichtheid is toegenomen tot ongeveer 85-90% confluentie in T75 flessen. Deze polyester cellen behouden hun vermogen om astrocyten worden ondanks dat in een medium dat selecteert de oligodendrocyte fenotype zodat na A2B5 immunopanning nodig zijn om een ​​hoog verrijkt polyester populatie te houden. Immunopanning algebondgenoot rendementen tot 95% A2B5 + cellen, maar voor een nog grotere opbrengst A2B5 geconjugeerde magnetische korrels (Miltenyi Biotec Inc) kan gebruikt worden om een ​​maximaal rendement van 97% voorzien worden. Waakzaamheid in het onderhoud GRP culturen zoals reguliere media veranderingen zullen het minimaliseren van de verspreiding van niet-GRP celtypen. Ook bij afwezigheid van BMP-4 astrocyten kunnen nog gevonden en uitgeput media in het bijzonder blijkt induceren een astrocytic fenotype. Hoewel B27 supplement bevat tri-jodothyronine hormoon (T3), is er geen waargenomen neiging om te differentiëren tot oligodendrocyten in de polyester populatie, alleen wanneer hogere T3 worden toegevoegd aan het medium betekent dit verschijnsel optreedt. Echter, een T3 gratis B27 supplement worden vervangen als er een punt van zorg voor de besmetting met volwassen oligodendrocyten (Figuur 1B). Deze GRP cellen kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door hun morfologie van kleine soma met 2 of 3 korte processen, maar om te screenen op andere celtypen die aanwezig kunnen zijn, immunocytochemistry kan worden uitgevoerd voor de eerder genoemde gemeenschappelijke ontwikkelings-en celtype specifieke markers. Er zal vaak een kleine duurzame populatie van A2B5-cellen die neuroepitheliale (NEP), die geschikt worden ofwel GRP of NHP. Gelukkig zijn de langere cellen gehandhaafd in de GRP medium hoe groter de kans dat medium kiest voor de GRP fenotype. Figuur 1. A) vernikkeld ruggenmergcellen heterogene morfologie worden waargenomen na 2 dagen kweek. B) Immunopanning zeer GRP verrijkte populatie maximale vanaf de start heterogene pool.