Derivazione di precursori gliali limitati dalla E13 topi

Introduzione In questo protocollo si mostra come estrarre, selezionare e piastra gliali ristrette precursore (GRP), le cellule dal midollo spinale di feti di topo E13. Queste cellule sono i primi precursori all'interno delle linee cellulari oligodendrocitario e astrociti e sono definite dalla loro espressione di A2B5. Nel medio GRP integrato con FGF-2, i A2B5 GRPs + inizierà esprimere primi oligodendrocitario lignaggio marcatori PDGFαR e NG2 1,2. Queste cellule della linea oligodendrociti passano attraverso una serie di distinte fasi fenotipici, ognuno caratterizzato da cambiamenti morfologici, nonché l'espressione di marcatori a specifici stadi di sviluppo. Queste cellule precursori sono attualmente in fase di studio come una fonte potenziale di approcci terapeutici basati su celle a disordini della materia bianca del sistema nervoso centrale, inclusa la sclerosi multipla, leucodistrofie e leucomalacia periventricolare (PVL) 3,4,5,6 </sup>. Gli studi che utilizzano cervello umano lignaggio derivato precursori degli oligodendrociti hanno riferito di rimielinizzazione con successo nel cervello del modello dismielinizzazione shiverer del mouse così come nei modelli demielinizzati del midollo spinale di roditori 6,7,8,9. Queste cellule precursori gliali sono state utilizzate anche in studi condotti su altri modelli della materia bianca malattie come le lesioni del midollo spinale e la sclerosi laterale amiotrofica 10,11,12,13. Il nostro laboratorio ha sviluppato un precoce postnatale ipossia-ischemia modello di topo con i quali stiamo valutando l'efficacia di queste cellule derivate dal midollo spinale GRP come un approccio restauro in PVL, la principale causa di paralisi cerebrale 14,15,16. Vi è anche un cervello roditore derivato modello OPC che è stato ampiamente utilizzato per studiare lesioni materia bianca poiché le cellule GRP hanno la tendenza a differenziarsi nel percorso astrocitica 17. Il fenotipo OPC è già entrato nel percorso degli oligodendrociti lignaggio, un fenomeno che sembra irreversible. Tuttavia, siamo interessati a valutare la risposta di un più ampio spettro di cellule progenitrici degli oligodendrociti tra GRP e forse anche la NEP derivati ​​a E10.5. Per questo motivo abbiamo adottato il modello di midollo spinale derivato GRP per il nostro lavoro. Oltre all'uso di GRPs per la sostituzione delle cellule, la derivazione di queste cellule di tipo selvatico e modelli di roditori transgenici di malattie della sostanza bianca consente ulteriori studi in differenziazione gliale in condizioni normali e di malattia in un ambiente in vitro. Pubblicazioni precedenti mostrano segni di vulnerabilità selettiva delle cellule precursori oligodendrocitario di derivazione per vari fattori di stress esterni, come eccitotossicità del glutammato maturazione dipendente, stress ossidativo, e di selezionare i fattori implicati nella neuroinfiammazione 18,19. I nostri studi si sono concentrati sulla comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari alla base dello sviluppo di queste lesioni della sostanza bianca, valutare la sensibilità di cellule inlo spettro degli oligodendrociti lignaggio di insultare così come l'analisi putativi approcci terapeutici. Materiale Tutte le procedure che coinvolgono animali sono conformi alle politiche e il PHS IACUC JHU. Tutte le operazioni devono essere eseguite in una cappa a flusso laminare per mantenere condizioni asettiche. Comunemente dissezioni vengono eseguite in una cappa a flusso orizzontale ed in vitro di lavoro in una cappa a flusso verticale. Tutti i mezzi utilizzati freddo durante dissezioni. I topi utilizzati nel nostro studio sono un tipo selvaggio CD-1 e un ceppo transgenico GFP in uno sfondo C57/BL6. Un CD-1 diga del mouse si ottiene in genere da 10 feti + che sono sufficienti per seme 1-2 T25 fiaschi. In genere, due dighe sono sacrificati in un momento e midollo spinale del feto in pool e placcato in 1 T25 pallone per diga. Una volta che le cellule sono state derivate possono essere espansi e caratterizzati in vitro per studi successivi. 1. Preparazione di Media e fiaschi GRPterreno viene utilizzato come mezzo dissezione: DMEM / F12 1:1 (Invitrogen) + B27 (50x; Invitrogen) N2 (100x; Invitrogen) Supplementi e sieroalbumina bovina (BSA, 0,5% w / v). Dissociazione media: come mezzo di dissezione. Terreno di coltura: media magazzino GRP + FGF-2 (10-20 ng / ml; Invitrogen) ed eparina (1 mg / ml, Sigma). PLL / laminina rivestite 75 cm 2 o 25 cm 2 palloni (T75 e T25). Fiaschette per coltura tissutale (75 cm 2, Falcon) sono state rivestite con 15-20μg/ml Poly-L-lisina (PLL, Sigma) in H 2 O distillata, incubate a 37 ° C per 1 ora poi aspirato. Palloni vengono lavati con 1X PBS poi rivestita con 15-20 ug / ml di laminina (Sigma) in PBS a 37 ° C per 1 ora, poi aspirato e PBS fresco o supporti aggiunto finché le cellule sono pronte per essere placcato. Dopo rivestimento, flaconi non dovrebbe mai essere lasciata asciugare, ma può essere mantenuta in PBS o mezzi a 4 ° C per brevi periodi prima dell'uso. 2. Strumenti e Other Materiale Piastre di Petri: 4 per diga: 3 piastre di Petri per la dissezione (75 mm), un piatto di 20 mm per la raccolta dei cavi raccolte spinale. Forbici di grandi dimensioni (43 mm forbici operativi, Roboz) e pinze dei tessuti dell'addome per l'apertura della diga di s. Forbice piccola per sezionare l'utero e la rimozione dei feti (15 mm Forbici Micro dissezione, Roboz). Micro forbici a molla dissezione (6 mm) di sezionare il midollo spinale dei feti. Micro Pinza dissezione angolate per l'ancoraggio del corpo diga e fetale durante l'intervento chirurgico e in seguito la rimozione del midollo spinale, una volta esposta. 40 o 70 filtro cellule micrometro per la rimozione di detriti cellulari prima della placcatura. Tripsina 0,05% preriscaldata a 37 ° C. 10 mg / ml DNAse 1 (Sigma), preparato come un archivio di 100x (1 g / ml). Bio-hazard sacco per cadaveri animali. 15 e 50 ml provette per centrifuga per l'elaborazione estratto midollo spinale. 3. Determinazione Timed Pregnancy Dighe del mouse in stato di gravidanza o sono ordinati da fonti commerciali che specificano la consegna il giorno embrionale E12 o E13 dello sviluppo fetale o di gravidanza, riscontrata in-house. In breve, due femmine sono messi insieme con un maschio nel tardo pomeriggio e lasciato tutta la notte insieme. Il giorno successivo le femmine sono osservate per la presenza della spina muco vaginale posizione. Il tappo di muco è solo un'indicazione che si sia verificato così l'accoppiamento animali vengano successivamente pesati quotidianamente per monitorare la frequenza di aumento di peso. Il giorno si osserva il tappo di muco è definito come giorno uno embrionale (E1). 4. Tissue Derivazione Lavorare sotto una cappa a flusso orizzontale per mantenere condizioni di asetticità. Spruzzare il cofano e la zona di lavoro con etanolo 70%. Strumenti in autoclave o spray liberamente con il 70% di etanolo. Preparare gli strumenti, i media, e microscopio per l'uso. Versare 20 ml di mezzo di dissezione a freddo in sterile di Petrish. Anestetizzare animale con cloralio idrato (500 mg / kg) somministrato per via intraperitoneale (IP) seguita da dislocazione cervicale o decapitazione. Spruzzare la zona addominale della diga con il 70-90% di etanolo (disinfezione) Aprire addome con forbice grande e pinze. In CD1 e C57/BL6 ceppi: Di ​​solito da 8 a 14 feti sarà all'interno dell'utero. Il numero dei feti è sforzo dipendente. Estrarre l'utero del mouse compresi i cuccioli e mettere in fresco mezzo di dissezione a freddo in un piatto pulito Petri per lavare il sangue e frammenti di tessuto dal feto. Estrarre ogni feto dalla tromba uterina e separarli dalla placenta e il sacco embrionale con le forbici di piccole dimensioni. Trasferire i feti estratti in media dissezione fresca in un nuovo piatto Petri. Mezzo di dissezione deve essere a bassa temperatura per abbassare l'attività metabolica e preservare la vitalità di cellule derivate. Lavorare da ora in poi con due pinze emicro dissezione primaverili-forbici. Lavorare sotto il microscopio di dissezione, tagliare la pelle lungo il midollo spinale con le forbici chirurgiche e micro pelle a buccia di nuovo per esporre il midollo spinale. Transetto il midollo spinale con le forbici microchirurgia a circa C1 e all'inizio della coda. Togliere il midollo spinale con le pinze smussate, verificare le ossa e la cartilagine sono stati rimossi e il trasferimento al 3 ° capsula di Petri di dissezione media. Per evitare la crescita eccessiva del tessuto meningea in colture cellulari successive tenta di rimuovere il più delle meningi il più possibile dal midollo spinale. A causa delle nascenti nervi periferici sporgenti questo è più difficile rimuovere il tessuto meningeo estratto dal cervello. Una volta meningi sono stati rimossi, trasferire midollo spinale al piatto mm 20 Petri Pulire dal fondo spruzzando la superficie con etanolo al 70-90%. Le seguenti operazioni per la dissociazione dovrebbe essere fatto in fretta per mantenereuno alta vitalità del tessuto derivata midollo spinale. 5. Istituzione Cultura Tripsina deve essere pre-riscaldato per almeno 30 min a 37 ° CH 2 O-bagno. Una aliquota appropriata dovrebbe essere rimosso dal magazzino per ridurre l'esposizione delle scorte alle fluttuazioni di temperatura. Trasferire le corde raccolte spinale ad un tubo da centrifuga da 50 ml contenente 10 ml preriscaldata tripsina (0,05%; qualità Biologicals) e 100 pl DNAsi (10 mg / ml) e triturare brevemente. Incubare a 37 ° CH 2 O-bagno per 10 minuti. Triturare e incubare per altri 10 minuti. Aggiungere 5 ml GRP medio (definito sopra) e centrifugare per 5 min a 1000 RPM. Aspirare il surnatante e risospendere pellet con 10 ml di terreno GRP e aggiungere DNAse-1 (10 mg / ml, Sigma). Incubare a 37 ° CH 2 O-bagno per 10 minuti. Centrifugare 5 min a 1000 RPM e aspirare il surnatante. Risospendere il pellet con fresh medie GRP poi detriti filtro con un 40-70 micron filtro cell. Piastra il PLL / laminina rivestita 25 centimetri (2 fiasche T25) e incubare a 37 ° C, 95% di umidità e 5% CO 2. 100 media% cambia il giorno successivo. A questo punto, GRP hanno attaccato e ha iniziato estendere i processi. 6. Immunopanning della popolazione GRP Tessuto del midollo spinale Piastra in PLL / laminina rivestite fiaschi fino a pallone è 85-90% confluenti o circa una settimana. Cellule Harvest raschiando pallone con un poliziotto in gomma o con il 0,05% tripsina, triturare accuratamente ma delicatamente, centrifugare a 1000 rpm per 5 min e accuratamente risospendere pellet con 3 ml di terreno GRP. Trasferire 1 ml ciascuna a 3 T25 palloni o 3 ml a 1 T75 pallone di aggiungere volumi adeguati di mezzo per coprire completamente le cellule e permettono di raggiungere palloni 80-90% di confluenza. Variazione media ogni altro giorno, prima, se di media consuma in fretta. Coat batteriologica Pepiatti tri (75 mm) notte a 4 ° C con un anticorpo anti-topo IgM (Southern Biotech), 10 pg / ml in PBS. Aspirare il tampone in eccesso e lavare i piatti Petri 3x con PBS. Aggiungere anticorpo A2B5 (Millipore) ad una concentrazione di 5 pg / ml diluito in PBS e incubare per 1 ora a temperatura ambiente (RT). Lavare le piastre ancora una volta con PBS 3x poi aggiungere 8 ml di mezzo di GRP contro l'essiccamento della piastra. Trasferire 5 ml di terreno GRP da piastre di Petri e cellule GRP raccolto raschiando palloni con un poliziotto in gomma per staccare tutte le cellule Triturare sospensione cellulare brevemente per rompere grumi e trasferire 5 ml di sospensione cellulare per le A2B5 rivestite piatti batteriologici Petri. Incubare 1 ora a temperatura ambiente senza agitazione. Dopo 1 ora supporti aspirato e piatti lavaggio 8x con PBS. Raschiare delicatamente le cellule con un poliziotto in gomma in 2 ml GRP supporti poi il trasferimento a PLL / laminina piastre rivestite o fiaschi con un volume adeguato di mezzo di GRP. </li> 7. Congelamento e conservazione di cellule derivate Le cellule sono raccolte da un 85-90% confluenti T25 o T75 pallone con 2 ml di tripsina 0,05%. La tripsina viene diluito e inattivato con mezzo 8ml archivio di GRP e centrifugate a 1000 rpm per 5 min. Pellets da T25 beute vengono risospese in 1 ml di mezzo congelamento GRP, (media archivio di GRP integrato con 10% (v / v) di DMSO e facoltativamente, FBS 20%). I granuli più grandi palloni da T75 sono diluiti due volte. Sospensioni cellulari di 1,5 x 10 – 3 10,11,12,13 cellule vengono trasferiti in fiale criogeniche (Nalgene) e conservato durante la notte in un contenitore criogenico (Nalgene) contenente isopropanolo a -80 ° C a congelare lentamente durante la notte. A seguito di celle di congelamento durante la notte vengono trasferite alle caselle freezer e conservati da 6 mesi a 1 anno a -80 ° C o più a lungo termine in N (l). Cellule scongelate sono tipicamente 60-80% realizzabile in funzione soprattutto della qualità del PLL / laminina rivestimento. </ol> 8. Risultati rappresentativi CO 2 non è utilizzato per anestetizzare l'animale a causa dei possibili effetti a valle sulla vitalità dei feti e, infine, le cellule derivate. Inoltre, sarà molto difficile da rimuovere completamente le meningi dal midollo spinale durante la procedura di derivazione, ma la combinazione di mezzo GRP e immunopanning eliminerà queste cellule in rapida crescita. Allo stesso modo, il midollo spinale è tutto raccolto, nonostante una maggiore concentrazione ventrale della popolazione GRP a causa della sua origine nel midollo spinale ventrale e la migrazione dorsalmente 20. Tuttavia il mezzo di GRP seleziona per il fenotipo GRP e che la popolazione è massimizzato A2B5 immunopanning. Dopo la placcatura del midollo spinale, le colture in vitro sono incubate per due passaggi o circa una settimana. Dopo 2 giorni di coltura, le cellule di morfologie differenti possono essere osservati in fiaschette per coltura dei tessuti indicanti il ​​eterogeneità della popolazione ma il mezzo GRP seleziona per il fenotipo GRP. Queste cellule sono una combinazione di A2B5 + GRP, E-NCAM + precursori neuronali ristrette (PNR) e nestina + e A2B5-neuroepiteliale cellule e possibilmente fibronectina + meningee cellule. Inoltre, i fenotipi più mature possono essere presenti che esprimono i marcatori tra cui doublecortin e Tuj1 per lineage neuronale, GFAP per gli astrociti e PDGFaR e GALC per lignaggio oligo Al fine di massimizzare altamente GRP popolazione arricchito dal pool eterogeneo di partenza (Figura 1A), le cellule possono essere a doppio immunopanned per selezionare ed eliminare le e-NCAM + cellule seguite da selezione per la A2B5 + popolazione GRP, una volta la densità delle cellule è aumentata a circa il 85-90% di confluenza in fiasche T75. Queste cellule GRP mantenere la loro capacità di diventare astrociti, pur essendo in un mezzo che seleziona per il fenotipo degli oligodendrociti in modo conseguente A2B5 immunopanning può essere necessario per mantenere una popolazione altamente arricchito GRP. Immunopanning generendimenti alleato fino al 95% A2B5 + cellule, ma per la resa ancora maggiore A2B5 perline magnetiche coniugate (Miltenyi Biotec Inc.) può essere usato per fornire una resa fino al 97%. Vigilanza nelle culture GRP le funzioni di manutenzione come ad esempio le normali modifiche multimediali ridurrà al minimo la proliferazione di non-GRP tipi di cellule. Anche in assenza di BMP-4 astrociti possono ancora essere trovati e mezzi impoverito in particolare sembra indurre la differenziazione di un fenotipo astrociti. Sebbene l'integratore B27 contiene tri-iodotironina ormone (T3), vi è stata osservata alcuna tendenza a differenziarsi in oligodendrociti nella popolazione GRP, solo quando livelli più elevati di T3 vengono aggiunti al mezzo di questo fenomeno si verifica. Tuttavia, un T3 libero B27 integratore può essere sostituito se c'è una preoccupazione per la contaminazione da oligodendrociti maturi (figura 1B). Queste cellule GRP possono essere facilmente identificati dalla loro morfologia di soma con 2 o 3 processi brevi ma a schermo per altri tipi di cellule che possono essere presenti, immunocytochemistry può essere eseguita per i precedentemente citati marcatori comuni tipo di sviluppo e delle cellule specifiche. Ci sarà comunemente una piccola popolazione persistente di A2B5 le cellule che sono neuroepiteliale (NEP) e capace di diventare uno GRP o PNR. Fortunatamente, le cellule sono mantenute più a lungo nel terreno GRP più è probabile che il mezzo viene selezionato per il fenotipo GRP. Figura 1. A) placcati in cellule del midollo spinale di morfologia eterogenei sono stati osservati dopo 2 giorni di coltura. B) Immunopanning GRP massimizza una popolazione altamente arricchito dal pool eterogeneo di partenza.