Органотипической культур Кусочек Эмбриональные Брюшной мозга: системы по изучению дофаминергической нейронов развития В пробирке</em
Summary
Метод для создания органотипической ломтики из мышиных эмбриональных E12.5 мозга описывается. Органотипической культур срез может быть использован для наблюдения поведения дофаминергических нейронов вентральной или других нейронов мозга.
Abstract
Мышь отличная модель организма для изучения развития млекопитающих мозг из-за обилия молекулярных и генетических данных. Тем не менее, развивается мозг мыши не подходит для легкого манипулирования и обработки изображений в естественных условиях, поскольку мышь эмбрион недоступной и непрозрачной. Органотипической культур кусочек эмбрионального мозга, таким образом, широко используются для изучения мышиной развития мозга в лабораторных условиях. Экс-живом манипуляций или использования трансгенных мышей позволяет изменение экспрессии генов, так что субпопуляции нейронов или глиальных клеток могут быть помечены флуоресцентным белкам. Поведение меченых клеток можно наблюдать использованием замедленной съемки. Покадровый изображений был особенно успешным для изучения ячейки поведения, которые лежат в основе развития коры головного мозга на поздних эмбриональных стадий 1-2. Эмбриональные органотипической срез культуры системами в областях мозга, вне переднего мозга в меньшей степени establisHed. Таким образом, богатство покадровой визуализации данных описывающих миграцию нейронов ячейке ограничен переднего мозга 3,4. До сих пор не известно, будь то принципы открыл для спинного мозга справедливы для вентральной области мозга. В вентральной мозга, нейроны организованы в кластеры нейронов, а не слои и им часто приходится проходить сложные миграционные траектории, чтобы достигнуть их окончательной позиции. Вентрального среднего мозга является не только хорошей модельной системой для вентральной развития мозга, а также содержит нейронные популяции, такие как дофаминергических нейронов, которые имеют отношение в болезненные процессы. Хотя функции и дегенерации дофаминергических нейронов были исследованы очень подробно в взрослых и старение мозга, мало известно о поведении этих нейронов во время их дифференциации и миграции фазы 5. Мы описываем здесь поколения срез культуры от эмбриональных день (E) 12,5 мыши вентрального среднего мозга. Эти ломтик культаUres которые потенциально пригодны для мониторинга развития дофаминергических нейронов в течение нескольких дней в лабораторных условиях. Мы отмечаем важные шаги в формировании мозга срезов на этих ранних стадиях эмбрионального развития и обсудить условия, необходимые для поддержания нормального развития дофаминергических нейронов в пробирке. Мы также представим результаты экспериментов промежуток времени визуализации. В этих экспериментах вентральной прекурсоров мозга (в том числе дофаминергических прекурсоров) и их потомки были названы в мозаике способом, используя Cre / loxP основан индуцибельной судьбу системы картографирования 6.
Protocol
Discussion
Органотипической метод культуры часть представленных здесь обеспечивает систему для краткосрочных в пробирке анализ развития дофаминергических нейронов и их миграционные маршруты и проекции в эмбриональном вентрального среднего мозга. Мы обнаружили, что Есть ряд важных шагов …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Мартина Emond и Изабель Брахман за помощь в создании системы органотипической культуры нарезать и Вольфганг Хюбнер и Ливиу Габриэль Bodea за критическое прочтение рукописи. Мы хотели бы поблагодарить Фрэнка Costantini для R26 репортер мышей и Клифф Табин для Тсс мышей CreER. Это исследование было профинансировано исследований премию от Министерства науки и исследований земли Северный Рейн-Вестфалия (Программа цур Förderung дер Rückkehr де wissenschaftlichen Spitzennachwuchses AUS DEM Ausland).
Materials
Table of specific reagents and equipment
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Glucose 30% | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| DMEM (4,5g/L Glc., with L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Sigma-Aldrich | P4333-20 | |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | prepare 200mM stock and store at -20°C |
| UltraPure LMP agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Millicel inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| μ-dish 35 mm, low | Ibidi | 80136 | |
| Vibratome | Microm | HM 650V | |
| Razor Blade | Plano GmbH | 121-6 | |
| Histoacryl glue | BRAU9381104 | Braun Aesculap | |
| Perforated Spoon Dia diameter 15 mm |
Fine Science Tools | 10370 -18 | |
| Forceps 5 Dumoxel | Fine Science Tools | 11252 – 30 |
Antibodies used for immunostainings:
| Name of the antibody | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | AB152 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | MAB318 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-BrdU | BD Pharmingen | 555627 | Dilution 1:200 |
| Rabbit anti-cleaved caspase 3 | Cell Signaling Technology | 9661 | Dilution 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG-Alexa 488 | Invitrogen | A21206 | Dilution 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG-Cy3 | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | Dilution 1:200 |
References
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. 7 (2), 136-136 (2004).
- Martini, F. J. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136 (1), 41-41 (2009).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (2), a001834-a001834 (2010).
- Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29-29 (2007).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 21-21 (2007).
- Legue, E., Joyner, A. L. Genetic fate mapping using site-specific recombinases. Methods. Enzymol. 477, 153-153 (2010).
- Daza, R. A., Englund, C., Hevner, R. F. Organotypic slice culture of embryonic brain tissue. CSH Protoc. , (2007).
- Harfe, B. D. Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell. 118 (4), 517-517 (2004).
- Srinivas, S. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev. Biol. 1, 4-4 (2001).
- Joksimovic, M. Spatiotemporally separable Shh domains in the midbrain define distinct dopaminergic progenitor pools. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (45), 19185-19185 (2009).
- Blaess, S. Temporal-spatial changes in Sonic Hedgehog expression and signaling reveal different potentials of ventral mesencephalic progenitors to populate distinct ventral midbrain nuclei. Neural. Dev. 6 (1), 29-29 (2011).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3 (5), e159-e159 (2005).
