Culturas organotípicos rebanada de mesencéfalo ventral embrionario: Un sistema para estudiar el desarrollo neuronal dopaminérgica In vitro</em
Summary
Un método para generar cortes organotípicos del cerebro medio E12.5 embrionarias murinas se describe. Las culturas rebanada organotípicos se puede utilizar para observar el comportamiento de las neuronas dopaminérgicas o neuronas del cerebro medio ventral.
Abstract
El ratón es un organismo modelo excelente para estudiar el desarrollo del cerebro de mamíferos debido a la abundancia de datos moleculares y genéticos. Sin embargo, el cerebro del ratón en desarrollo no es adecuado para una fácil manipulación y de imágenes en vivo desde el embrión de ratón es inaccesible y opaco. Cultivos organotípicos trozo de cerebro embrionario, por lo tanto ampliamente utilizado para estudiar el desarrollo del cerebro murino in vitro. Ex-vivo la manipulación o el uso de ratones transgénicos que permite la modificación de la expresión génica a fin de que las subpoblaciones de células neuronales o gliales pueden ser etiquetados con proteínas fluorescentes. El comportamiento de las células marcadas se puede observar mediante time-lapse de imágenes. Time-lapse de imágenes ha sido particularmente exitoso para el estudio de los comportamientos celulares que subyacen en el desarrollo de la corteza cerebral en las últimas etapas embrionarias 1-2. Embrionarias sistemas organotípicos cultura de división en regiones del cerebro fuera del cerebro anterior se estableci menoshed. Por lo tanto, la riqueza de los datos de time-lapse de imágenes que describen la migración de las células neuronales se limita al cerebro anterior 3,4. Todavía no se conoce, si los principios descubiertos por el cerebro dorsal son válidas para las áreas del cerebro ventral. En el cerebro ventral, las neuronas se organizan en grupos neuronales en lugar de capas y muchas veces tienen que someterse a complicadas trayectorias migratorias para alcanzar su posición final. El cerebro medio ventral no sólo es un buen modelo de sistema para el desarrollo cerebral ventral, pero también contiene poblaciones neuronales, tales como las neuronas dopaminérgicas que son relevantes en los procesos de enfermedad. Mientras que la función y la degeneración de las neuronas dopaminérgicas se ha investigado en gran detalle en el adulto y el envejecimiento del cerebro, se sabe poco sobre el comportamiento de estas neuronas durante su diferenciación y la fase de migración 5. Se describe aquí la generación de culturas de corte a partir del día embrionario (E) 12,5 mesencéfalo ventral del ratón. Estos culto rebanadadas son potencialmente adecuados para vigilar el desarrollo de neuronas dopaminérgicas en varios días in vitro. Se destacan los pasos críticos en la generación de cortes de cerebro en las primeras etapas del desarrollo embrionario y discutir las condiciones necesarias para mantener el desarrollo normal de las neuronas dopaminérgicas in vitro. También se presentan los resultados de los experimentos de imagen en tiempo transcurrido. En estos experimentos, los precursores del mesencéfalo ventral (incluidos los precursores dopaminérgicos) y sus descendientes fueron etiquetados en forma de mosaico con un Cre / loxP destino basado inducible sistema de mapeo 6.
Protocol
Discussion
El método slice cultura organotípicos presentada aquí, proporciona un sistema para el corto plazo en el desarrollo de análisis in vitro de neuronas dopaminérgicas y sus rutas migratorias y la proyección en el mesencéfalo ventral embrionario. Hemos encontrado que hay una serie de pasos críticos en el protocolo que debe ser cuidadosamente atendidos para obtener cortes que permiten el desarrollo normal de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo ventral. El paso más crítico es la disección…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Martine Emond y Brachmann Isabel por su ayuda en el establecimiento del sistema de corte y la cultura organotípicos Wolfgang Hübner y Liviu Gabriel Bodea para la lectura crítica del manuscrito. Nos gustaría dar las gracias a Frank Costantini para el R26 ratones reportero y Tabin Acantilado de los ratones CREER Shh. Este estudio fue financiado por un Premio de Investigación del Ministerio de Ciencia e Investigación del Norte-Westfalia (Programm zur Förderung der Rückkehr des wissenschaftlichen Spitzennachwuchses aus dem Ausland).
Materials
Table of specific reagents and equipment
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Glucose 30% | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| DMEM (4,5g/L Glc., with L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Sigma-Aldrich | P4333-20 | |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | prepare 200mM stock and store at -20°C |
| UltraPure LMP agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Millicel inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| μ-dish 35 mm, low | Ibidi | 80136 | |
| Vibratome | Microm | HM 650V | |
| Razor Blade | Plano GmbH | 121-6 | |
| Histoacryl glue | BRAU9381104 | Braun Aesculap | |
| Perforated Spoon Dia diameter 15 mm |
Fine Science Tools | 10370 -18 | |
| Forceps 5 Dumoxel | Fine Science Tools | 11252 – 30 |
Antibodies used for immunostainings:
| Name of the antibody | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | AB152 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | MAB318 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-BrdU | BD Pharmingen | 555627 | Dilution 1:200 |
| Rabbit anti-cleaved caspase 3 | Cell Signaling Technology | 9661 | Dilution 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG-Alexa 488 | Invitrogen | A21206 | Dilution 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG-Cy3 | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | Dilution 1:200 |
References
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