פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה</em
Summary
שיטה לייצר פרוסות organotypic מן המוח התיכון E12.5 העוברי Murine מתואר. תרבויות פרוסה organotypic ניתן להשתמש כדי לבחון את התנהגות של נוירונים דופאמינרגיים או נוירונים המוח התיכון הגחון.
Abstract
העכבר הוא אורגניזם מודל מצוין ללמוד התפתחות המוח יונקים בשל שפע של נתונים מולקולריים וגנטיים. עם זאת, המוח המתפתח העכבר אינו מתאים מניפולציה הדמיה קל in vivo מאז העובר העכבר אינו נגיש ואטומים. תרבויות פרוסה Organotypic של המוח העוברי ולכן הם בשימוש נרחב ללמוד התפתחות המוח Murine במבחנה. Ex-vivo מניפולציה או שימוש העכברים הטרנסגניים מאפשר שינוי של ביטוי גנים, כך subpopulations של תאים עצביים או גליה יכול להיות מתויג עם חלבוני ניאון. התנהגותם של תאים שכותרתו לאחר מכן ניתן לצפות באמצעות זמן לשגות הדמיה. זמן לשגות הדמיה הצליחה במיוחד עבור הלומדים התנהגויות תא העומדים בבסיס התפתחות קליפת המוח בשלבים עובריים בסוף 1-2. עובריים organotypic תרבות פרוסה מערכות באזורי מוח מחוץ forebrain הם establis גם פחותהד. לכן, שפע של זמן לשגות נתונים הדמיה המתאר נדידת תאים עצביים מוגבל forebrain 3,4. זה עדיין לא ידוע, אם גילה את העקרונות למוח הגב להחזיק נכון עבור אזורים במוח הגחון. במוח הגחון, הנוירונים מאורגנים בקבוצות ולא שכבות עצביות ולעתים קרובות הם צריכים לעבור מסלולי הנדידה מסובך להגיע עמדתו הסופית שלהם. המוח התיכון הגחון הוא לא רק מערכת מודל טוב להתפתחות המוח הגחון, אך מכיל גם באוכלוסיות עצביות כגון נוירונים דופאמינרגיים הרלוונטיים בתהליכי מחלה. בעוד לתפקד ניוון של נוירונים דופאמינרגיים נחקר בפירוט רב המבוגר והמוח המזדקן, מעט מאוד ידוע על התנהגותם של הנוירונים האלה במהלך הבידול שלהם שלב ההגירה 5. אנו מתארים כאן דור של תרבויות פרוסה מיום עובריים (E) 12.5 המוח התיכון עכבר הגחון. אלה פולחן פרוסהures מתאימים פוטנציאלי לניטור דופאמין פיתוח הנוירון על פני כמה ימים במבחנה. אנו מדגישים את השלבים הקריטיים ביצירת פרוסות המוח על אלה בשלבים המוקדמים של ההתפתחות העוברית ולדון את התנאים ההכרחיים לשמירה על התפתחות תקינה של נוירונים דופאמינרגיים במבחנה. כמו כן, אנו מציגים תוצאות של ניסויים זמן לשגות הדמיה. בניסויים אלו, מבשרי המוח התיכון הגחון (כולל מבשרי דופאמין) וצאצאיהם תויגו באופן פסיפס באמצעות Cre / loxP ועין מתנהלת מערכת מיפוי מבוסס גורל 6.
Protocol
Discussion
פרוסה organotypic תרבות השיטה המוצגת כאן מספקת מערכת לטווח הקצר בניתוח חוץ גופית לפתח נוירונים דופאמינרגיים ומסלולי הנדידה והשלכה שלהם המוח התיכון הגחון עובריים. מצאנו כי ישנם מספר צעדים קריטיים בפרוטוקול כי יש בהשתתפות בקפידה על מנת לקבל פרוסות המאפשרים התפתחות ת?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים מרטין אמונד ואיזבל Brachmann על עזרתם בהקמת פרוסה organotypic תרבות מערכת וולפגנג הובנר ו ליביו גבריאל Bodea לקריאה ביקורתית של כתב היד. ברצוננו להודות פרנק Costantini עבור R26 עכברים הכתב תבין קליף עבור העכברים קואל ששש. מחקר זה מומן על ידי פרס מחקר מטעם משרד המדע המחקר של צפון ריין וסטפליה (programm zur Förderung דר Rückkehr des wissenschaftlichen Spitzennachwuchses aus dem Ausland).
Materials
Table of specific reagents and equipment
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Glucose 30% | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| DMEM (4,5g/L Glc., with L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Sigma-Aldrich | P4333-20 | |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | prepare 200mM stock and store at -20°C |
| UltraPure LMP agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Millicel inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| μ-dish 35 mm, low | Ibidi | 80136 | |
| Vibratome | Microm | HM 650V | |
| Razor Blade | Plano GmbH | 121-6 | |
| Histoacryl glue | BRAU9381104 | Braun Aesculap | |
| Perforated Spoon Dia diameter 15 mm |
Fine Science Tools | 10370 -18 | |
| Forceps 5 Dumoxel | Fine Science Tools | 11252 – 30 |
Antibodies used for immunostainings:
| Name of the antibody | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | AB152 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | MAB318 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-BrdU | BD Pharmingen | 555627 | Dilution 1:200 |
| Rabbit anti-cleaved caspase 3 | Cell Signaling Technology | 9661 | Dilution 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG-Alexa 488 | Invitrogen | A21206 | Dilution 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG-Cy3 | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | Dilution 1:200 |
References
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. 7 (2), 136-136 (2004).
- Martini, F. J. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136 (1), 41-41 (2009).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (2), a001834-a001834 (2010).
- Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29-29 (2007).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 21-21 (2007).
- Legue, E., Joyner, A. L. Genetic fate mapping using site-specific recombinases. Methods. Enzymol. 477, 153-153 (2010).
- Daza, R. A., Englund, C., Hevner, R. F. Organotypic slice culture of embryonic brain tissue. CSH Protoc. , (2007).
- Harfe, B. D. Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell. 118 (4), 517-517 (2004).
- Srinivas, S. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev. Biol. 1, 4-4 (2001).
- Joksimovic, M. Spatiotemporally separable Shh domains in the midbrain define distinct dopaminergic progenitor pools. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (45), 19185-19185 (2009).
- Blaess, S. Temporal-spatial changes in Sonic Hedgehog expression and signaling reveal different potentials of ventral mesencephalic progenitors to populate distinct ventral midbrain nuclei. Neural. Dev. 6 (1), 29-29 (2011).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3 (5), e159-e159 (2005).
