Cultures organotypique de mésencéphale ventral embryonnaire: Un système pour étudier le développement neuronal dopaminergique In vitro</em
Summary
Une méthode pour générer des tranches organotypiques de l'embryon murin E12.5 mésencéphale est décrite. Les cultures organotypique peut être utilisé pour observer le comportement des neurones dopaminergiques du mésencéphale ou d'autres neurones ventraux.
Abstract
La souris est un organisme excellent modèle pour étudier le développement du cerveau des mammifères en raison de l'abondance de données moléculaires et génétiques. Toutefois, le cerveau de souris en développement n'est pas adapté pour la manipulation facile et d'imagerie in vivo, depuis l'embryon de souris est inaccessible et opaque. Cultures organotypique de cerveaux embryonnaires sont donc largement utilisées pour étudier le développement du cerveau murin in vitro. Ex-vivo la manipulation ou l'utilisation de souris transgéniques permet la modification de l'expression génique afin que les sous-populations de cellules neuronales ou gliales peuvent être étiquetés avec des protéines fluorescentes. Le comportement des cellules marquées peuvent alors être observés à l'aide imagerie time-lapse. Time-lapse d'imagerie a été particulièrement fructueuse pour l'étude des comportements cellulaires qui sous-tendent le développement du cortex cérébral à la fin des stades embryonnaires 1-2. Embryonnaire des systèmes de culture organotypiques de tranches dans les régions du cerveau en dehors du cerveau antérieur sont establis moins bienhed. Par conséquent, la richesse des données d'imagerie time-lapse décrivant la migration des cellules neuronales est limitée à 3,4 le prosencéphale. Il n'est pas encore connu, si les principes découverts par le cerveau dorsale vrai pour les zones du cerveau ventral. Dans le cerveau ventrale, les neurones sont organisés en grappes neuronale plutôt que des couches et ils ont souvent à subir les trajectoires migratoires complexes pour atteindre leur position finale. Le mésencéphale ventral est non seulement un bon modèle pour le développement du cerveau ventral, mais contient aussi des populations neuronales comme les neurones dopaminergiques qui sont pertinentes dans les processus de la maladie. Alors que la fonction et la dégénérescence des neurones dopaminergiques a été étudiée en détail chez l'adulte et le vieillissement du cerveau, on connaît peu le comportement de ces neurones au cours de leur différenciation et 5 phase de migration. Nous décrivons ici la génération des cultures tranche du jour embryonnaire (E) 12,5 mésencéphale ventral de la souris. Ces cultes trancheres sont potentiellement adaptés à la surveillance développement des neurones dopaminergiques sur plusieurs jours in vitro. Nous mettons en évidence les étapes critiques dans la génération des tranches de cerveau à ces stades précoces du développement embryonnaire et de discuter les conditions nécessaires pour maintenir un développement normal des neurones dopaminergiques in vitro. Nous avons également présenter les résultats des expériences d'imagerie time lapse. Dans ces expériences, les précurseurs du mésencéphale ventral (y compris les précurseurs dopaminergiques) et leurs descendants ont été étiquetés de manière à l'aide d'une mosaïque de Cre / loxP système de cartographie basée sur le destin inductible 6.
Protocol
Discussion
La méthode organotypique culture présentées ici fournit un système pour le court terme dans l'analyse in vitro des neurones dopaminergiques de développement et de leurs routes migratoires et de projection dans le mésencéphale embryonnaire ventrale. Nous avons trouvé qu'il ya un certain nombre d'étapes critiques dans le protocole qui doit être soignée afin d'obtenir des tranches qui permettent le développement normal des neurones dopaminergiques du mésencéphale ventral. L'étape…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Martine Emond et Isabel Brachmann pour leur aide dans l'établissement du système de tranches organotypiques culture et Wolfgang Hübner et Liviu Gabriel Bodea pour la lecture critique du manuscrit. Nous tenons à remercier Frank Costantini pour le R26 souris Cliff Tabin journaliste et pour les souris CREER Shh. Cette étude a été financée par une bourse de recherche du ministère de la Science et la Recherche de la Rhénanie du Nord Westphalie (Programm zur Förderung der Rückkehr des wissenschaftlichen aus dem Ausland Spitzennachwuchses).
Materials
Table of specific reagents and equipment
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Glucose 30% | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| DMEM (4,5g/L Glc., with L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Sigma-Aldrich | P4333-20 | |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | prepare 200mM stock and store at -20°C |
| UltraPure LMP agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Millicel inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| μ-dish 35 mm, low | Ibidi | 80136 | |
| Vibratome | Microm | HM 650V | |
| Razor Blade | Plano GmbH | 121-6 | |
| Histoacryl glue | BRAU9381104 | Braun Aesculap | |
| Perforated Spoon Dia diameter 15 mm |
Fine Science Tools | 10370 -18 | |
| Forceps 5 Dumoxel | Fine Science Tools | 11252 – 30 |
Antibodies used for immunostainings:
| Name of the antibody | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | AB152 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | MAB318 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-BrdU | BD Pharmingen | 555627 | Dilution 1:200 |
| Rabbit anti-cleaved caspase 3 | Cell Signaling Technology | 9661 | Dilution 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG-Alexa 488 | Invitrogen | A21206 | Dilution 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG-Cy3 | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | Dilution 1:200 |
References
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