الثقافات شريحة عضوي النمط من المخ الأوسط بطني الجنينية : نظام لدراسة التنمية متعلق بالخلايا العصبية الدوبامينية في المختبر</em
Summary
يوصف أسلوب لتوليد شرائح عضوي النمط من الدماغ المتوسط E12.5 الفئران الجنينية. يمكن استخدام شريحة عضوي النمط الثقافات لمراقبة سلوك الخلايا العصبية الدوبامين العصبية الدماغ المتوسط أو غيرها من بطني.
Abstract
الفأر هو كائن نموذجا ممتازا لدراسة تطور الدماغ لدى الثدييات بسبب وفرة من البيانات الجزيئية والجينية. ومع ذلك ، فإن مخ الفأر النامية ليست مناسبة للتلاعب السهل والتصوير في الجسم الحي منذ جنين الفأر لا يمكن الوصول إليها وغير شفافة. ولذلك فإن الثقافات شريحة عضوي النمط من العقول الجنينية المستخدمة على نطاق واسع لدراسة تطور الدماغ الفئران في المختبر. السابقين فيفو تلاعب أو استخدام الفئران المعدلة وراثيا يسمح تعديل الجينات بحيث يمكن تسمية مجموعات سكانية فرعية من الخلايا العصبية أو الدبقية مع البروتينات الفلورية. ويمكن بعد ذلك على سلوك الخلايا المسمى يراعى استخدام الوقت الفاصل بين التصوير. وقد الوقت الفاصل بين التصوير ناجحة بشكل خاص لدراسة سلوك الخلية التي تكمن وراء تطور قشرة الدماغ في المراحل الجنينية في وقت متأخر 1-2. الجنينية ثقافة شريحة عضوي النمط النظم في مناطق الدماغ خارج الدماغ المقدم establis هي أقلهد]. لذلك ، يقتصر ثروة من البيانات التصوير الوقت الفاصل بين الخلايا العصبية التي تصف هجرة الخلية إلى 3،4 الدماغ المقدم. ما زال من غير المعروف ما إذا كانت المبادئ اكتشفت للدماغ الظهرية ينطبق على مناطق الدماغ البطني. في الدماغ البطني ، ويتم تنظيم الخلايا العصبية في مجموعات الخلايا العصبية بدلا من الطبقات وغالبا ما يتعين عليها الخضوع لمسارات معقدة للوصول إلى المهاجرة موقفهم النهائي. الدماغ المتوسط في بطني ليست مجرد نظام نموذجا جيدا للتطور الدماغ البطني ، ولكن أيضا على السكان العصبية مثل الدوبامين العصبية التي هي ذات الصلة في عمليات المرض. في حين تم التحقيق فيها وظيفة وتنكس الخلايا العصبية الدوبامين بتفصيل كبير في تعليم الكبار والمخ من الشيخوخة ، لا يعرف إلا القليل عن سلوك هذه الخلايا العصبية خلال مرحلة التمايز والهجرة 5. نحن هنا وصف الجيل الثقافات شريحة من اليوم الجنينية (E) الدماغ المتوسط 12.5 الماوس البطني. هذه شريحة عبادةures ويحتمل أن تكون مناسبة لرصد الخلايا العصبية الدوبامين التنمية على مدى عدة ايام في المختبر. نسلط الضوء على الخطوات الحاسمة في توليد شرائح الدماغ في هذه المراحل المبكرة من التطور الجنيني ، ومناقشة الشروط اللازمة للحفاظ على النمو الطبيعي للخلايا العصبية الدوبامين في المختبر. نحن أيضا نتائج التجارب الوقت الحاضر من التصوير الفاصل. في هذه التجارب ، وصفت السلائف بطني الدماغ المتوسط (بما في ذلك السلائف الدوبامين) وذريتهم بطريقة الفسيفساء باستخدام لجنة المساواة العرقية / loxP مصير محرض نظام يستند تعيين 6.
Protocol
Discussion
ثقافة شريحة عضوي النمط الطريقة المعروضة هنا يوفر النظام على المدى القصير في تحليل المختبر لتطوير الخلايا العصبية الدوبامين ومسارات هجرتها والإسقاط في الدماغ المتوسط في بطني الجنينية. وجدنا أن هناك عددا من الخطوات الحاسمة في البروتوكول الذي ينبغي أن حض…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مارتين Emond Brachmann وإيزابيل لمساعدتهم في تأسيس ثقافة شريحة عضوي النمط النظام وولفغانغ هوبنر ليفيو وغابرييل Bodea لقراءة نقدية للمخطوطة. نود أن نشكر Costantini فرانك لمراسل R26 الفئران وكليف تابين للفئران CreER SHH. وقد تم تمويل هذه الدراسة من قبل على جائزة بحوث من وزارة العلوم والبحوث وشمال الراين وستفاليا (البرنامج للزور Förderung دير Rückkehr قصر wissenschaftlichen Spitzennachwuchses أسترالي Ausland ماركا).
Materials
Table of specific reagents and equipment
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Glucose 30% | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| DMEM (4,5g/L Glc., with L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Sigma-Aldrich | P4333-20 | |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | prepare 200mM stock and store at -20°C |
| UltraPure LMP agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Millicel inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| μ-dish 35 mm, low | Ibidi | 80136 | |
| Vibratome | Microm | HM 650V | |
| Razor Blade | Plano GmbH | 121-6 | |
| Histoacryl glue | BRAU9381104 | Braun Aesculap | |
| Perforated Spoon Dia diameter 15 mm |
Fine Science Tools | 10370 -18 | |
| Forceps 5 Dumoxel | Fine Science Tools | 11252 – 30 |
Antibodies used for immunostainings:
| Name of the antibody | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | AB152 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | MAB318 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-BrdU | BD Pharmingen | 555627 | Dilution 1:200 |
| Rabbit anti-cleaved caspase 3 | Cell Signaling Technology | 9661 | Dilution 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG-Alexa 488 | Invitrogen | A21206 | Dilution 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG-Cy3 | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | Dilution 1:200 |
References
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. 7 (2), 136-136 (2004).
- Martini, F. J. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136 (1), 41-41 (2009).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (2), a001834-a001834 (2010).
- Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29-29 (2007).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 21-21 (2007).
- Legue, E., Joyner, A. L. Genetic fate mapping using site-specific recombinases. Methods. Enzymol. 477, 153-153 (2010).
- Daza, R. A., Englund, C., Hevner, R. F. Organotypic slice culture of embryonic brain tissue. CSH Protoc. , (2007).
- Harfe, B. D. Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell. 118 (4), 517-517 (2004).
- Srinivas, S. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev. Biol. 1, 4-4 (2001).
- Joksimovic, M. Spatiotemporally separable Shh domains in the midbrain define distinct dopaminergic progenitor pools. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (45), 19185-19185 (2009).
- Blaess, S. Temporal-spatial changes in Sonic Hedgehog expression and signaling reveal different potentials of ventral mesencephalic progenitors to populate distinct ventral midbrain nuclei. Neural. Dev. 6 (1), 29-29 (2011).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3 (5), e159-e159 (2005).
