Summary

Colorectal Cancer Cell Surface Protein profilage utilisant une biopuces d'anticorps et de multiplexage par fluorescence

Published: September 25, 2011
doi:

Summary

Nous avons décrit une procédure pour la désagrégation du cancer colorectal (CCR) pour produire des cellules viables unique, qui sont ensuite saisies sur biopuces d'anticorps reconnaissant les antigènes de surface sur mesure (CRC DotScan micropuce). Les sous-populations de cellules lié à la puce peut être profilée par multiplexage de fluorescence à l'aide d'anticorps monoclonaux marqués avec des colorants fluorescents.

Abstract

Le pronostic actuel et la classification des CRC repose sur la stadification des systèmes qui intègrent les résultats histopathologiques et cliniques. Cependant, dans la majorité des cas de CCR, le dysfonctionnement cellulaire est le résultat de nombreuses mutations qui modifient l'expression des protéines et des modifications post-traductionnelles 1.

Un certain nombre d'antigènes de surface cellulaire, y compris les clusters de différenciation (CD) antigènes, ont été identifiés comme pronostiques potentiels ou métastatique chez les biomarqueurs CRC. Ces antigènes font biomarqueurs idéal comme leur expression change souvent avec la progression tumorale ou des interactions avec d'autres types cellulaires, comme les lymphocytes infiltrant les tumeurs (TIL) et les macrophages associés aux tumeurs (TAM).

L'utilisation de l'immunohistochimie (IHC) pour le cancer de la sous-classification et le pronostic est bien établi pour certains types de tumeurs 2,3. Cependant, pas un seul «marqueur» a montré l'importance pronostique supérieure clinico-pathologiques ou de mise en scène gagné l'acceptation large pour une utilisation dans les rapports de pathologie de routine de tous les cas, le CRC.

Une approche plus récente à la stratification pronostique des phénotypes de la maladie repose sur les profils protéiques de surface en utilisant de multiples «marqueurs». Alors que le profil d'expression des tumeurs en utilisant des techniques telles que la protéomique iTRAQ est un outil puissant pour la découverte de biomarkers4, il n'est pas optimale pour une utilisation de routine dans les laboratoires de diagnostic et ne peuvent pas distinguer différents types de cellules dans une population mixte. En outre, de grandes quantités de tissus tumoraux sont nécessaires pour le profilage des glycoprotéines purifiées membrane plasmique par ces méthodes.

Dans cette vidéo, nous avons décrit une méthode simple pour le profilage de la surface du protéome de cellules viables à partir d'échantillons CRC ventilées en utilisant une puce à anticorps DotScan CRC. La puce 122-anticorps se compose d'une norme 82-anticorps reconnaissant la région une gamme de la lignée des marqueurs spécifiques des leucocytes, des molécules d'adhésion, les récepteurs et les marqueurs de l'inflammation et la réponse immunitaire 5, avec une région par satellite pour la détection de 40 marqueurs potentiellement pronostique pour le CRC . Les cellules sont capturées uniquement sur les anticorps pour lequel ils expriment l'antigène correspondant. La densité cellulaire par point, déterminé par balayage optique, reflète la proportion de cellules exprimant l'antigène, le niveau d'expression de l'antigène et l'affinité de l'anticorps 6.

Pour les tissus normaux CRC ou la muqueuse intestinale, balayages optiques reflètent l'immunophénotype des populations mixtes de cellules. Multiplexage par fluorescence peut alors être utilisé pour le profil sélectionné sous-populations de cellules d'intérêt capturés sur le tableau. Par exemple, Alexa 647 molécules anti-adhérence des cellules épithéliales (EpCAM; CD326), est un antigène de différenciation pan-épithéliales qui a été utilisé pour détecter les cellules CRC et aussi les cellules épithéliales de la muqueuse intestinale normale, tandis que la phycoérythrine-anticorps anti-CD3, a été utilisé pour détecter l'infiltration de cellules T 7. Le CRC DotScan biopuces devrait être le prototype d'une alternative de diagnostic pour le système anatomique basée sur scène CRC.

Protocol

Le flux de travail figure 1. Pour la préparation d'une suspension de cellules vivantes à partir d'un échantillon de chirurgie de la CRC. 1. Désagrégation de l'échantillon clinique Tous les échantillons ont été prélevés dans l'hôpital Royal Prince Alfred (Camperdown, NSW, Australie) et l'Hôpital de rapatriement Concord (Concord West, NSW, Australie…

Discussion

Dans cette vidéo, nous démontrons comment les biopuces d'anticorps DotScan peut être utilisé dans un simple, semi-quantitative façon d'étudier les profils d'antigène de surface pour les populations de cellules du tissu CRC.

L'obtention d'une suspension de cellules viables unique à partir de tissus est essentielle à la réussite de l'expérience, parce que dépendant de l'énergie des processus (par exemple, l'antigène le recouvrement et / ou la forma…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le personnel des laboratoires de pathologie anatomique du Royal Prince Alfred et les hôpitaux rapatriement Concord pour la collecte des échantillons frais du CRC et de la muqueuse intestinale normale. Le travail a été financé par une subvention Cancer Institute Nouvelle-Galles du Sud Programme translationnelle.

Materials

Name of reagent or equipment Company Catalogue number Comments
Hanks’ balanced salt solution Sigma-Aldrich H6136-10X1L Buffered with 25 mM Hepes (Sigma #H3375)
Airpure biological safety cabinet class II Westinghouse 1687-2340/612  
Surgical blades Livingstone 090609 Pack of 100
RPMI 1640 with 2 mM Hepes Sigma-Aldrich R4130-10X1L  
Collagenase type 4 Worthington 4188  
Deoxyribonuclease 1 Sigma-Aldrich DN25-1G  
Terumo Syringe (10 mL) Terumo SS+10L Box of 100
Filcon filter (200 μm) BD Biosciences 340615  
Filcon filter (50 μm) Filcon filter (50 μm) Filcon filter (50 μm) Filcon filter (50 μm) 340603  
Fetal calf serum Gibco/Invitrogen 10099-141  
Centrifuge 5810 R Eppendorf 7017  
Dimethyl sulphoxide Sigma-Aldrich D2650  
Trypan blue Sigma-Aldrich T8154  
Hemocymeter Technocolor Neubar Hirschmann not available  
Light microscope Nikon Nikon TMS  
Cyrovial tubes Greiner bio-one 121278  
Cryo freezing contrainer Nalgene 5100-0001  
DotScan antibody microarray kit Medsaic not available  
DotScan microarray wash tray Medsaic not available  
KimWipes Kimberly-Clark 4103  
Formaldehyde 37% Sigma-Aldrich F1635-500ML  
DotReaderTM Medsaic not available  
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9418-10G  
Heat-inactivated AB serum 2% Invitrogen 34005100  
Phycoerythrin-conjugated CD3 Beckman Coulter ET386  
AlexaFluor647-conjugated EpCAM BioLegend 324212  
Typhoon FLA 9000 GE Healthcare 28-9558-08 532 nm laser, 580 BP30 emission filter for PE. 633 nm laser and 670 BP30 emission filter for Alexa647
MultiExperiment Viewer v4.4 TM4 Microarray Software Suite Open – source software (Ref 11)  

References

  1. Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer. Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297 (2002).
  2. Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D. National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: adjuvant therapy for breast cancer. J. Natl. Canc. Inst. 93, 979 (2001).
  3. Swerdlow, S. H., Campo, E., Harris, H. L., Jaffe, E. S., Pileri, S. A., Stein, H., Thiele, J., Vardiman, J. W. WHO classification of tumour of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC WHO Classification of Tumours. 2, (2008).
  4. Xiao, G. G., Recker, R. R., Deng, H. W. Recent advances in proteomics and cancer biomarker discovery. Clin. Med. Oncol. , (2008).
  5. Belov, L., Mulligan, S. P., Barber, N., Woolfson, A., Scott, M., Stoner, K., Chrisp, J. S., Sewell, W. A., Bradstock, K. F., Bandall, L., Pascovici, D. S., Thomas, M., Erber, W., Huang, P., et al. Analysis of human leukaemias and lymphomas using extensive immunophenotypes from an antibody microarray. Br. J. Haematol. 135, 184 (2006).
  6. Belov, L., Huang, P., Barber, N., Mulligan, S. P., Christopherson, R. I. Identification of repertories of surface antigens on leukemias using an antibody microarray. Proteomics. 3, 2147 (2003).
  7. Zhou, J., Belov, L., Huang, P. Y., Shin, J., Solomon, M. J., Chapuis, P. H., Bokey, L., Chan, C., Clarke, C., Clarke, S. J., Christopherson, R. I. Surface antigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays with fluorescence multiplexing. J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 40-51 (2010).
  8. Ellmark, P., Belov, L., Huang, P., Lee, C. S., Solomon, M. J., Morgan, D. K., Christopherson, R. I. Multiplex detection of surface molecules on colorectal cancers. Proteomics. 6, 1791 (2006).
  9. Pearson, J. P., Allen, A., Hutton, D. A. Rheology of mucin. Methods Mol. Biol. 125, 99 (2000).
  10. Yang, Y. H., Dudoit, S., Luu, P., Lin, D. M., Peng, V., Ngai, J., Speed, T. P. Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation. Nucleic Acids Res. 30, 15 (2002).
  11. Al Saeed, ., et al. TMA: A free, open-source system for microarray data management and analysis. BioTechniques. 34, 374-378 (2003).

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Cite This Article
Zhou, J., Belov, L., Solomon, M. J., Chan, C., Clarke, S. J., Christopherson, R. I. Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing. J. Vis. Exp. (55), e3322, doi:10.3791/3322 (2011).

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