Colorectal Cancer Cell oppervlakte-eiwit Profiling Met behulp van een antilichaam Microarray en fluorescentie Multiplexing
Summary
Beschreven wij een procedure voor het uiteenvallen van colorectale kanker (CRC) levensvatbare enkele cellen, die vervolgens worden opgevangen op maat antilichaam microarrays herkennen van oppervlakte-antigenen (DotScan CRC microarray) te produceren. Subpopulaties van cellen gebonden aan de microarray kan worden geprofileerd door fluorescentie multiplexen behulp van monoklonale antilichamen gelabeld met een fluorescerende kleurstoffen.
Abstract
De huidige prognose en de classificatie van de CRC is gebaseerd op enscenering systemen die histopathologische en klinische bevindingen te integreren. Echter, in het merendeel van de CRC gevallen cel disfunctie is het resultaat van talrijke mutaties die eiwit-expressie en post-translationele modificatie 1 te wijzigen.
Een aantal van de cel-oppervlakte-antigenen, met inbegrip van clustervorming van differentiatie (CD) antigenen, zijn geïdentificeerd als potentiële prognostische of gemetastaseerde biomarkers in CRC. Deze antigenen zijn ideale biomarkers als hun uitdrukking vaak verandert met tumorprogressie of interacties met andere celtypen, zoals tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL) en tumor-geassocieerde macrofagen (TAM).
Het gebruik van immunohistochemie (IHC) voor kanker sub-classificatie en prognose is goed vastgesteld voor bepaalde typen tumoren 2,3. Er is echter geen enkele 'marker' zien prognostische waarde groter is dan klinisch-pathologische staging of algemeen geaccepteerd voor gebruik in de routine pathologie rapportage van alle CRC gevallen.
Een meer recente benadering van de prognostische stratificatie van de ziekte fenotypes is gebaseerd op oppervlakte-eiwit profielen met behulp van meerdere 'markers'. Terwijl de expressie profilering van tumoren met behulp van proteomics technieken zoals iTRAQ is een krachtig hulpmiddel voor de ontdekking van biomarkers4, is het niet optimaal voor dagelijks gebruik in diagnostische laboratoria en kunnen niet verschillende celtypen te onderscheiden in een gemengde bevolking. Daarnaast worden grote hoeveelheden van het tumorweefsel nodig zijn voor de profilering van gezuiverde plasmamembraan glycoproteïnen van deze methoden.
In deze video beschreven we een eenvoudige methode voor oppervlakte-proteomics van levensvatbare cellen van uitgesplitste CRC monsters met behulp van een DotScan CRC antilichaam microarray. De 122-antilichaam microarray bestaat uit een standaard 82-antilichaam regio herkennen van een reeks van lijn-specifieke leukocyten markers, adhesie-moleculen, receptoren en merkers van inflammatie en immuunrespons 5, samen met een satelliet-regio voor de detectie van 40 potentieel prognostische markers voor CRC . Cellen zijn vastgelegd alleen op antilichamen voor die zij uitdragen de bijbehorende antigeen. De cel dichtheid per punt, bepaald door optische scanning, weerspiegelt het aandeel van de cellen die dat antigeen, het niveau van expressie van het antigeen en affiniteit van het antilichaam 6.
Voor CRC weefsel of normale darmslijmvlies, optische scans weerspiegelen de immunofenotype van gemengde populaties van cellen. Fluorescentie multiplexing kan vervolgens worden gebruikt om de geselecteerde sub-populaties van cellen van belang gevangen op de array profiel. Bijvoorbeeld, Alexa 647-anti-epitheliale cellen (EpCAM, CD326), is een pan-epitheliale differentiatie antigeen dat gebruikt werd om CRC cellen en ook de epitheliale cellen van de normale darmslijmvlies te detecteren, terwijl de phycoerythrine-anti-CD3, werd gebruikt op te sporen infiltrerende T-cellen 7. De DotScan CRC microarray moet het prototype voor een diagnostisch alternatief voor de anatomisch-based CRC staging systeem.
Protocol
Discussion
In deze video laten we zien hoe de DotScan antilichaam microarray kan gebruikt worden in een eenvoudige, semi-kwantitatieve manier om de oppervlakte-antigeen profielen studie voor celpopulaties van CRC weefsel.
Het verkrijgen van een levensvatbare enkele celsuspensie van weefsel is cruciaal voor het succes van het experiment, omdat energie-afhankelijke processen (bijv., antigeen aftopping en / of pseudopodia vorming) lijken noodzakelijk voor een stevige binding van hele cellen om antilichame…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken personeel van de anatomische pathologie laboratoria van het Royal Prince Alfred en Concord Repatriëring ziekenhuizen voor het verzamelen van verse monsters van CRC en normale darmslijmvlies. Het werk werd gefinancierd door een Cancer Institute New South Wales Translational Program Grant.
Materials
| Name of reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6136-10X1L | Buffered with 25 mM Hepes (Sigma #H3375) |
| Airpure biological safety cabinet class II | Westinghouse | 1687-2340/612 | |
| Surgical blades | Livingstone | 090609 | Pack of 100 |
| RPMI 1640 with 2 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R4130-10X1L | |
| Collagenase type 4 | Worthington | 4188 | |
| Deoxyribonuclease 1 | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Terumo Syringe (10 mL) | Terumo | SS+10L | Box of 100 |
| Filcon filter (200 μm) | BD Biosciences | 340615 | |
| Filcon filter (50 μm) | Filcon filter (50 μm) | Filcon filter (50 μm) Filcon filter (50 μm) 340603 | |
| Fetal calf serum | Gibco/Invitrogen | 10099-141 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 7017 | |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Hemocymeter Technocolor Neubar | Hirschmann | not available | |
| Light microscope | Nikon | Nikon TMS | |
| Cyrovial tubes | Greiner bio-one | 121278 | |
| Cryo freezing contrainer | Nalgene | 5100-0001 | |
| DotScan antibody microarray kit | Medsaic | not available | |
| DotScan microarray wash tray | Medsaic | not available | |
| KimWipes | Kimberly-Clark | 4103 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | |
| DotReaderTM | Medsaic | not available | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
| Heat-inactivated AB serum 2% | Invitrogen | 34005100 | |
| Phycoerythrin-conjugated CD3 | Beckman Coulter | ET386 | |
| AlexaFluor647-conjugated EpCAM | BioLegend | 324212 | |
| Typhoon FLA 9000 | GE Healthcare | 28-9558-08 | 532 nm laser, 580 BP30 emission filter for PE. 633 nm laser and 670 BP30 emission filter for Alexa647 |
| MultiExperiment Viewer v4.4 | TM4 Microarray Software Suite | Open – source software (Ref 11) |
References
- Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer. Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297 (2002).
- Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D. National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: adjuvant therapy for breast cancer. J. Natl. Canc. Inst. 93, 979 (2001).
- Swerdlow, S. H., Campo, E., Harris, H. L., Jaffe, E. S., Pileri, S. A., Stein, H., Thiele, J., Vardiman, J. W. WHO classification of tumour of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC WHO Classification of Tumours. 2, (2008).
- Xiao, G. G., Recker, R. R., Deng, H. W. Recent advances in proteomics and cancer biomarker discovery. Clin. Med. Oncol. , (2008).
- Belov, L., Mulligan, S. P., Barber, N., Woolfson, A., Scott, M., Stoner, K., Chrisp, J. S., Sewell, W. A., Bradstock, K. F., Bandall, L., Pascovici, D. S., Thomas, M., Erber, W., Huang, P., et al. Analysis of human leukaemias and lymphomas using extensive immunophenotypes from an antibody microarray. Br. J. Haematol. 135, 184 (2006).
- Belov, L., Huang, P., Barber, N., Mulligan, S. P., Christopherson, R. I. Identification of repertories of surface antigens on leukemias using an antibody microarray. Proteomics. 3, 2147 (2003).
- Zhou, J., Belov, L., Huang, P. Y., Shin, J., Solomon, M. J., Chapuis, P. H., Bokey, L., Chan, C., Clarke, C., Clarke, S. J., Christopherson, R. I. Surface antigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays with fluorescence multiplexing. J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 40-51 (2010).
- Ellmark, P., Belov, L., Huang, P., Lee, C. S., Solomon, M. J., Morgan, D. K., Christopherson, R. I. Multiplex detection of surface molecules on colorectal cancers. Proteomics. 6, 1791 (2006).
- Pearson, J. P., Allen, A., Hutton, D. A. Rheology of mucin. Methods Mol. Biol. 125, 99 (2000).
- Yang, Y. H., Dudoit, S., Luu, P., Lin, D. M., Peng, V., Ngai, J., Speed, T. P. Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation. Nucleic Acids Res. 30, 15 (2002).
- Al Saeed, ., et al. TMA: A free, open-source system for microarray data management and analysis. BioTechniques. 34, 374-378 (2003).
