Summary

סרטן המעי הגס Cell Surface חלבון פרופיל שימוש microarray ו ריבוב נוגדן פלואורסצנטי

Published: September 25, 2011
doi:

Summary

אנו תיאר הליך disaggregation של סרטן המעי (CRC) לייצר תאים בודדים קיימא, אשר נלכדים אז על microarrays נוגדן אישית הכרה אנטיגנים השטח (DotScan microarray CRC). תת אוכלוסיות של תאים חייב microarray ניתן צדודית על ידי ריבוב הקרינה באמצעות נוגדנים חד שבטיים מתוייגים עם צבעי ניאון.

Abstract

הפרוגנוזה הסיווג הנוכחי של CRC מסתמך על היערכות מערכות המשלבים היסטופתולוגיות ממצאים קליניים. עם זאת, ברוב המקרים CRC, תפקוד לקוי של התא היא תוצאה של מוטציות רבים לשנות ביטוי חלבון ופוסט translational שינוי 1.

מספר פני השטח אנטיגנים התא, כולל מקבץ של (CD) אנטיגנים בידול, זוהו סמנים פרוגנוסטיים פוטנציאליים או גרורתי CRC. אנטיגנים אלה הופכים סמנים אידיאלי כביטוי שלהם לעתים קרובות שינויים עם התקדמות הגידול או אינטראקציות עם סוגי תאים אחרים, כגון גידולים הסתננות לימפוציטים (TILs) לבין גידולים הקשורים מקרופאגים (TAMs).

השימוש אימונוהיסטוכימיה (IHC) לטיפול בסרטן תת סיווג התחזית מבוססת היטב של כמה סוגי גידולים 2,3. עם זאת, לא "סמן" יחיד הוכיח משמעות פרוגנוסטית יותר מאשר הזמני המרפאה-פתולוגי או צבר הסכמה רחבה לשימוש דיווח הפתולוגיה שגרתי בכל המקרים CRC.

גישה האחרונות יותר ריבוד פרוגנוסטיים של המחלה פנוטיפים מסתמך על פני השטח באמצעות חלבון פרופילים מרובים "סמנים". בעוד פרופיל הביטוי של גידולים תוך שימוש בטכניקות proteomic כגון iTRAQ הוא כלי רב עוצמה על גילוי biomarkers4, זה לא אופטימלי לשימוש שגרתי במעבדות אבחון אינה יכולה להבחין סוגי תאים שונים באוכלוסייה מעורבת. בנוסף, כמויות גדולות של רקמת הגידול נדרשים עבור פרופיל של קרום גליקופרוטאינים מטוהרים פלזמה בשיטות אלה.

בסרטון הזה תיארנו שיטה פשוטה אפיון פני השטח של תאים proteome קיימא מן disaggregated דגימות CRC באמצעות microarray CRC DotScan נוגדן. Microarray 122-נוגדן מורכב באזור 82-נוגדן תקן להכיר מגוון של השושלת הסמנים הספציפיים ליקוציט, מולקולות הדבקה, קולטנים סמנים של דלקת התגובה החיסונית 5, יחד עם האזור לווין לגילוי של 40 סמנים פרוגנוסטיים פוטנציאלי עבור CRC . תאים הם כבשו רק על נוגדנים שהם מבטאים את האנטיגן המתאים. צפיפות התאים לכל נקודה, נקבע על ידי סורק אופטי, משקף את חלקם של התאים לבטא כי אנטיגן, רמת הביטוי של אנטיגן ואת הזיקה של הנוגדן 6.

עבור רקמת רירית המעי CRC או רגיל, סורק אופטי לשקף את immunophenotype של אוכלוסיות מעורבות של תאים. ריבוב Fluorescence לאחר מכן ניתן להשתמש בפרופיל הנבחר תת אוכלוסיות של תאים בעלי עניין שנתפסו על המערך. לדוגמה, 647-Alexa אנטי אפיתל הידבקות התא מולקולות (EpCAM; CD326), הוא אנטיגן הפאן אפיתל בידול ששימש לזהות תאים CRC גם לתאי האפיתל של רירית המעי נורמלי, בעוד Phycoerythrin אנטי-CD3, שימש כדי לזהות חדירה לתאי T-7. CRC DotScan microarray צריך להיות טיפוס אחר חלופה אבחון למערכת CRC אנטומית מבוססי הזמני.

Protocol

1. תרשים זרימה עבודה להכנת השעיה של תאים חיים ממדגם כירורגית של CRC. 1. מדגם קלינית disaggregation כל הדגימות נאספו הנסיך המלכותי אלפרד החולים (קמפרדאון, N…

Discussion

בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך microarray נוגדן DotScan ניתן להשתמש דרך פשוטה וכמותיות, ללמוד אנטיגן פרופילים השטח עבור אוכלוסיות תאים מרקמות CRC.

קבלת השעיה בת קיימא תא בודד מרקמת הוא קריטי להצלחה של הניסוי, כי האנרגיה תלויה בתהליכים (למשל, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לצוות על מעבדות פתולוגיה אנטומית של הנסיך המלכותי אלפרד חולים קונקורד והרפטריאציה לאיסוף דגימות טריים של CRC ו רירית מעיים רגילה. העבודה מומן על ידי מענק מכון הסרטן בניו דרום ויילס תוכנית Translational.

Materials

Name of reagent or equipment Company Catalogue number Comments
Hanks’ balanced salt solution Sigma-Aldrich H6136-10X1L Buffered with 25 mM Hepes (Sigma #H3375)
Airpure biological safety cabinet class II Westinghouse 1687-2340/612  
Surgical blades Livingstone 090609 Pack of 100
RPMI 1640 with 2 mM Hepes Sigma-Aldrich R4130-10X1L  
Collagenase type 4 Worthington 4188  
Deoxyribonuclease 1 Sigma-Aldrich DN25-1G  
Terumo Syringe (10 mL) Terumo SS+10L Box of 100
Filcon filter (200 μm) BD Biosciences 340615  
Filcon filter (50 μm) Filcon filter (50 μm) Filcon filter (50 μm) Filcon filter (50 μm) 340603  
Fetal calf serum Gibco/Invitrogen 10099-141  
Centrifuge 5810 R Eppendorf 7017  
Dimethyl sulphoxide Sigma-Aldrich D2650  
Trypan blue Sigma-Aldrich T8154  
Hemocymeter Technocolor Neubar Hirschmann not available  
Light microscope Nikon Nikon TMS  
Cyrovial tubes Greiner bio-one 121278  
Cryo freezing contrainer Nalgene 5100-0001  
DotScan antibody microarray kit Medsaic not available  
DotScan microarray wash tray Medsaic not available  
KimWipes Kimberly-Clark 4103  
Formaldehyde 37% Sigma-Aldrich F1635-500ML  
DotReaderTM Medsaic not available  
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9418-10G  
Heat-inactivated AB serum 2% Invitrogen 34005100  
Phycoerythrin-conjugated CD3 Beckman Coulter ET386  
AlexaFluor647-conjugated EpCAM BioLegend 324212  
Typhoon FLA 9000 GE Healthcare 28-9558-08 532 nm laser, 580 BP30 emission filter for PE. 633 nm laser and 670 BP30 emission filter for Alexa647
MultiExperiment Viewer v4.4 TM4 Microarray Software Suite Open – source software (Ref 11)  

References

  1. Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer. Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297 (2002).
  2. Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D. National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: adjuvant therapy for breast cancer. J. Natl. Canc. Inst. 93, 979 (2001).
  3. Swerdlow, S. H., Campo, E., Harris, H. L., Jaffe, E. S., Pileri, S. A., Stein, H., Thiele, J., Vardiman, J. W. WHO classification of tumour of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC WHO Classification of Tumours. 2, (2008).
  4. Xiao, G. G., Recker, R. R., Deng, H. W. Recent advances in proteomics and cancer biomarker discovery. Clin. Med. Oncol. , (2008).
  5. Belov, L., Mulligan, S. P., Barber, N., Woolfson, A., Scott, M., Stoner, K., Chrisp, J. S., Sewell, W. A., Bradstock, K. F., Bandall, L., Pascovici, D. S., Thomas, M., Erber, W., Huang, P., et al. Analysis of human leukaemias and lymphomas using extensive immunophenotypes from an antibody microarray. Br. J. Haematol. 135, 184 (2006).
  6. Belov, L., Huang, P., Barber, N., Mulligan, S. P., Christopherson, R. I. Identification of repertories of surface antigens on leukemias using an antibody microarray. Proteomics. 3, 2147 (2003).
  7. Zhou, J., Belov, L., Huang, P. Y., Shin, J., Solomon, M. J., Chapuis, P. H., Bokey, L., Chan, C., Clarke, C., Clarke, S. J., Christopherson, R. I. Surface antigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays with fluorescence multiplexing. J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 40-51 (2010).
  8. Ellmark, P., Belov, L., Huang, P., Lee, C. S., Solomon, M. J., Morgan, D. K., Christopherson, R. I. Multiplex detection of surface molecules on colorectal cancers. Proteomics. 6, 1791 (2006).
  9. Pearson, J. P., Allen, A., Hutton, D. A. Rheology of mucin. Methods Mol. Biol. 125, 99 (2000).
  10. Yang, Y. H., Dudoit, S., Luu, P., Lin, D. M., Peng, V., Ngai, J., Speed, T. P. Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation. Nucleic Acids Res. 30, 15 (2002).
  11. Al Saeed, ., et al. TMA: A free, open-source system for microarray data management and analysis. BioTechniques. 34, 374-378 (2003).

Play Video

Cite This Article
Zhou, J., Belov, L., Solomon, M. J., Chan, C., Clarke, S. J., Christopherson, R. I. Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing. J. Vis. Exp. (55), e3322, doi:10.3791/3322 (2011).

View Video