Celular del cáncer colorrectal superficie de la proteína perfiles con un microarray de anticuerpos y la multiplexación de fluorescencia
Summary
Se describe un procedimiento para la desagregación de cáncer colorrectal (CCR) para producir células viables único, que son capturados en microarrays de anticuerpos a medida el reconocimiento de los antígenos de superficie (CRC DotScan microarrays). Subpoblaciones de células obligado a los microarrays pueden ser perfiladas por multiplexación de fluorescencia utilizando anticuerpos monoclonales marcados con colorantes fluorescentes.
Abstract
El pronóstico actual y la clasificación de la Convención se basa en la puesta en escena de sistemas que se integran los hallazgos histopatológicos y clínicos. Sin embargo, en la mayoría de los casos de CCR, disfunción de las células es el resultado de numerosas mutaciones que modifican la expresión de proteínas y modificaciones post-traduccionales 1.
Una serie de antígenos de superficie celular, incluyendo cluster de diferenciación (CD) antígenos, han sido identificados como potenciales de pronóstico o marcadores metastásicos en el CCR. Estos antígenos hacer biomarcadores ideal como su expresión cambia a menudo con la progresión del tumor o interacciones con otros tipos de células, como linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) y los macrófagos asociados al tumor (TAM).
El uso de la inmunohistoquímica (IHC) para el cáncer de sub-clasificación y el pronóstico está bien establecido para algunos tipos de tumores 2,3. Sin embargo, no solo "marcador" ha demostrado importancia pronóstica superior clínico-patológicas de ensayo o de ganado amplia aceptación para su uso en la presentación de informes de rutina de todos los casos la patología CRC.
Un enfoque más reciente de la estratificación pronóstica de los fenotipos de la enfermedad se basa en los perfiles de proteínas de superficie con varios "marcadores". Mientras que los perfiles de expresión de los tumores mediante técnicas proteómicas como iTRAQ es una poderosa herramienta para el descubrimiento de biomarkers4, no es el óptimo para su uso rutinario en los laboratorios de diagnóstico y no se pueden distinguir diferentes tipos de células en una población mixta. Además, grandes cantidades de tejido tumoral se requieren para la elaboración de perfiles de las glicoproteínas de la membrana plasmática purificada por estos métodos.
En este video se describe un método simple para crear perfiles de la superficie del proteoma de células viables de muestras desglosados CRC utilizando un microarray de anticuerpos DotScan CRC. Los microarrays 122-anticuerpo consiste en un estándar de 82-anticuerpo reconoce una amplia región del linaje de los marcadores específicos de leucocitos, las moléculas de adhesión, los receptores y los marcadores de inflamación y respuesta inmune 5, junto con una región por satélite para la detección de 40 marcadores potencialmente pronóstico de CRC . Las células son capturados sólo en los anticuerpos para los que expresan el antígeno correspondiente. La densidad de las células por punto, determinado por lectura óptica, refleja la proporción de células que expresan ese antígeno, el nivel de expresión del antígeno y la afinidad de los anticuerpos 6.
Para el tejido de la Convención o en la mucosa intestinal normal, las exploraciones ópticas reflejan el inmunofenotipo de la población mixta de células. Multiplexación de fluorescencia se puede utilizar con el perfil seleccionado sub-poblaciones de células de interés capturado en la matriz. Por ejemplo, Alexa molécula de adhesión celular 647-anti-epiteliales (EpCAM, CD326), es un antígeno de diferenciación pan-epiteliales que se usa para detectar células CRC y también las células epiteliales de la mucosa intestinal normal, mientras que ficoeritrina anti-CD3, se utilizó para detectar la infiltración de células T 7. El CRC DotScan microarrays debe ser el prototipo de una alternativa de diagnóstico para el sistema de clasificación anatómica basada en CRC.
Protocol
Discussion
En este video, que demuestran cómo los microarrays de anticuerpos DotScan se puede utilizar en una forma simple, semi-cuantitativo de manera de estudiar los perfiles de antígeno de superficie de las poblaciones de células del tejido CRC.
La obtención de una suspensión de células viables solo a partir de tejido es esencial para el éxito del experimento, ya que depende de la energía los procesos (por ejemplo, el antígeno de recubrimiento y / o la formación de pseudópodos) parecen se…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias al personal del Anatómico laboratorios de patología de la Royal Prince Alfred y Hospitales de Concordia repatriación de recogida de muestras frescas de la CRC y la mucosa intestinal normal. El trabajo fue financiado por una beca del Instituto del Cáncer de Nueva Gales del Sur Programa traslacional.
Materials
| Name of reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6136-10X1L | Buffered with 25 mM Hepes (Sigma #H3375) |
| Airpure biological safety cabinet class II | Westinghouse | 1687-2340/612 | |
| Surgical blades | Livingstone | 090609 | Pack of 100 |
| RPMI 1640 with 2 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R4130-10X1L | |
| Collagenase type 4 | Worthington | 4188 | |
| Deoxyribonuclease 1 | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Terumo Syringe (10 mL) | Terumo | SS+10L | Box of 100 |
| Filcon filter (200 μm) | BD Biosciences | 340615 | |
| Filcon filter (50 μm) | Filcon filter (50 μm) | Filcon filter (50 μm) Filcon filter (50 μm) 340603 | |
| Fetal calf serum | Gibco/Invitrogen | 10099-141 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 7017 | |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Hemocymeter Technocolor Neubar | Hirschmann | not available | |
| Light microscope | Nikon | Nikon TMS | |
| Cyrovial tubes | Greiner bio-one | 121278 | |
| Cryo freezing contrainer | Nalgene | 5100-0001 | |
| DotScan antibody microarray kit | Medsaic | not available | |
| DotScan microarray wash tray | Medsaic | not available | |
| KimWipes | Kimberly-Clark | 4103 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | |
| DotReaderTM | Medsaic | not available | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
| Heat-inactivated AB serum 2% | Invitrogen | 34005100 | |
| Phycoerythrin-conjugated CD3 | Beckman Coulter | ET386 | |
| AlexaFluor647-conjugated EpCAM | BioLegend | 324212 | |
| Typhoon FLA 9000 | GE Healthcare | 28-9558-08 | 532 nm laser, 580 BP30 emission filter for PE. 633 nm laser and 670 BP30 emission filter for Alexa647 |
| MultiExperiment Viewer v4.4 | TM4 Microarray Software Suite | Open – source software (Ref 11) |
References
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