שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות
Summary
שיטה זו מאפשרת אפיון של חיידקי המורחבת שיתוף תרבות עם EpiAirways, רקמות אפיתל הנשימה העיקרי האדם גדל ב ממשק אוויר הנוזל, רלוונטית מבחינה ביולוגית<em> במבחנה</em> מודל. הגישה ניתן להשתמש עם חיידק כלשהו ניתנת לטווח ארוך ושיתוף תרבות.
Abstract
Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) הם המדביקה בני אדם, חיידקים גראם שליליים, שעלולים לגרום לזיהומים חוזרים כרונית של רירית דרכי הנשימה 1, 2. כדי לחקור את המנגנונים שבאמצעותם אורגניזמים אלה לשרוד על ובתוך הרקמות בדרכי הנשימה, מודל שבו מוצלח לטווח ארוך שיתוף התרבות של חיידקים ותאי אדם יכול להתבצע נדרשת. אנו משתמשים העיקרי ברקמות אנושיות אפיתל הנשימה העלה לממשק אוויר נוזלי, מודל EpiAirway (MatTek, אשלנד, MA). אלה שאינם מונצחים היטב הבדיל, 3 מימדי רקמות שמכילות צמתים הדוקים, תאים ריסי ו nonciliated, תאים המייצרים הגביע mucin, ולשמר את היכולת לייצר ציטוקינים בתגובה לזיהום.
זה רלוונטי מבחינה ביולוגית במודל חוץ גופית של דרכי האוויר העליונות האנושית ניתן להשתמש במספר דרכים: המטרה הכוללת של שיטה זו הוא לבצע לטווח ארוך ושיתוף תרבות של רקמות EpiAirway עם NTHi ו לכמת תא הקשורים חיידקים הפנימו לאורך זמן . כמו כן, הייצור mucin את הפרופיל של ציטוקינים הנגוע שיתוף תרבויות ניתן לקבוע. גישה זו משפר עם השיטות הקיימות כי פרוטוקולים רבים כיום להשתמש שקוע monolayer או Transwell תרבויות של תאים אנושיים, אשר אינם מסוגלים לתמוך זיהומים חיידקיים לאורך תקופות ממושכות 3. לדוגמה, אם אורגניזם יכול לשכפל בתקשורת שמעליה, זה יכול לגרום לרמות מקובלות של cytotoxicity ואובדן של תאים המארח, לעצור את הניסוי. המודל EpiAirway מאפשר אפיון של לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות. יתר על כן, מאז המקור EpiAirway הוא אדם נורמלי tracheo-הסימפונות תאים ולא קו הנציח, כל אחד הוא ייצוג מעולה של רקמה אנושית בפועל בדרכי הנשימה העליונות, הן במבנה והן פונקציה 4.
בשיטה זו, הרקמות EpiAirway הם להיגמל של תרכובות אנטי מיקרוביאליים ואנטי פטרייתי עבור 2 ימים לפני הלידה, וכל ההליכים מתבצעים תחת אנטיביוטיקה ללא תנאים. זה מחייב שיקולים מיוחדים, שכן הן חיידקים ברקמות אנושיות העיקרי משמשים בממשלה biosafety אותו דבר, הם שיתוף תרבותי במשך תקופות ממושכות.
Protocol
Discussion
שיטה זו מאפשרת את חקירת לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות רקע רלוונטי מבחינה ביולוגית העיקרי של רקמות הנשימה האנושית ממשק אוויר הנוזל. כאן השתמשנו NTHi כמו הדבקה של האורגניזם, אבל האינטראקציה של חיידק כלשהו שאינו מקובל להציג cytotoxicity לאורך זמן ניתן לכמת בשיטה זו. המודל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות פטריק היידן (MatTek) לדיונים מועיל, ורוברט סמית ליבי פרי של גאורגיה למדעי הבריאות באוניברסיטת מיומנויות EM שלהם. מחקר זה מומן על ידי מענק NIDCD DC010187 לאבא
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue# | Comments |
|---|---|---|---|
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium | Lonza | 17-513Q | |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium | Lonza | 17-515Q | |
| EpiAirway antibiotic-free tissues | MatTek | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway antibiotic-free maintenance media | MatTek | AIR-100-MM-ABF | Supplied with kit |
| 10X phosphate-buffered saline solution | EMD | 6506 | Dilute to 1X before use |
| Gelatin | JT Baker | 2124-01 | Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave |
| Difco GC Medium Base (chocolate agar) | VWR | 90002-016 | Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C |
| BBL Hemoglobin (chocolate agar) | VWR | 90000-662 | Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above |
| BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) | VWR | 90000-414 | Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates |
| Dissecting forceps, fine tip, curved | VWR | 82027-406 | |
| Self-sealing sterilization pouches | VWR | 89140-802 | |
| Gentamicin sulfate, 10 mg/ml | Lonza | 17-519Z | Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill |
References
- Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
- Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children. Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).
- Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells. Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).
- Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies. J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).
- Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium. Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).
- Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components. Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).
- Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin. Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).
- Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicology. 244, 66-76 (2008).
- Fahy, J. V., Dickey, M. D. Airway mucus function and dysfunction. N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).
- Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -. D. Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi. 359, 691-696 (2007).
