Gebruik van de EpiAirway Model voor het karakteriseren van op lange termijn gastheer-pathogeen interacties
Summary
Deze methode maakt het mogelijk karakterisering van bacteriële uitgebreide co-cultuur met EpiAirways, primaire menselijke luchtwegen epitheelweefsel geteeld op de lucht-vloeistof interface, een biologisch relevante<em> In vitro</em> Model. De aanpak kan gebruikt worden met elke microbe die vatbaar is voor de lange termijn co-cultuur.
Abstract
Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) zijn mens-aangepast Gram-negatieve bacteriën die kunnen leiden tot recidiverende en chronische infecties van de luchtwegen mucosa 1, 2. Om de mechanismen die deze organismen overleven op en in de luchtwegen weefsels, een model waarin succesvolle lange-termijn co-cultuur van bacteriën en menselijke cellen kan worden uitgevoerd is vereist studie. We maken gebruik van primaire menselijke luchtwegen epitheelweefsels verhoogd tot de lucht-water grensvlak, de EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). Dit zijn niet-vereeuwigd, goed gedifferentieerde, 3-dimensionale weefsels die tight junctions, trilharen en nonciliated cellen, cellen die beker mucine produceren, en behouden de mogelijkheid om cytokines te produceren in reactie op de infectie in te dammen.
This biologisch relevante in vitro model van het menselijk bovenste luchtwegen kan worden gebruikt in een aantal manieren, de algemene doelstelling van deze methode is op lange termijn co-cultuur van EpiAirway weefsels met NTHi en kwantificeren cel-geassocieerd en geïnternaliseerde bacteriën uit te voeren in de tijd . Ook kunnen mucine de productie en het cytokine profiel van de geïnfecteerde co-culturen worden bepaald. Deze aanpak verbetert de bestaande methoden in dat veel van de huidige protocollen gebruiken ondergedompeld monolayer of Transwell culturen van menselijke cellen, die niet geschikt zijn voor bacteriële infecties gedurende langere perioden 3. Bijvoorbeeld, als een organisme kan repliceren in de bovenliggende media, kan dit leiden tot onaanvaardbare niveaus van de cytotoxiciteit en verlies van gastheercellen, de arrestatie van de experiment. Het EpiAirway model maakt het mogelijk de karakterisering van de lange termijn gastheer-pathogeen interacties. Verder, omdat de bron voor de EpiAirway is normaal menselijk tracheobronchiale cellen in plaats van een onsterfelijk lijn, elk is een uitstekende weergave van de werkelijke menselijke bovenste luchtwegen weefsel, zowel in structuur en in functie 4.
Voor deze methode, de EpiAirway weefsels zijn gespeend van anti-microbiële en anti-schimmel verbindingen voor twee dagen voorafgaand aan de levering, en alle procedures worden uitgevoerd onder antibiotica-vrije omstandigheden. Dit vereist speciale overwegingen, omdat zowel bacteriën en primaire menselijke weefsels worden gebruikt in dezelfde bioveiligheid kast, en zijn co-gekweekt voor langere perioden.
Protocol
Discussion
Deze methode maakt het mogelijk het onderzoek naar de lange termijn gastheer-pathogeen interacties in een biologisch relevante achtergrond van de primaire menselijke luchtwegen weefsels aan het lucht-vloeistof interface. Hier hebben we gebruikt NTHi als het infecterende organisme, maar de interactie van een bacterie die onaanvaardbare cytotoxiciteit niet te introduceren na verloop van tijd kunnen worden gekwantificeerd met deze methode. De EpiAirway model kan ook gebruikt worden voor de studie van virussen, drugs of che…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Patrick Hayden (MatTek) bedanken voor nuttige discussies, en Robert Smith en Libby Perry van Georgië Health Sciences University voor hun EM vaardigheden. Deze studie werd gefinancierd door het NIDCD, toont verlenen DC010187 naar DAD
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue# | Comments |
|---|---|---|---|
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium | Lonza | 17-513Q | |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium | Lonza | 17-515Q | |
| EpiAirway antibiotic-free tissues | MatTek | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway antibiotic-free maintenance media | MatTek | AIR-100-MM-ABF | Supplied with kit |
| 10X phosphate-buffered saline solution | EMD | 6506 | Dilute to 1X before use |
| Gelatin | JT Baker | 2124-01 | Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave |
| Difco GC Medium Base (chocolate agar) | VWR | 90002-016 | Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C |
| BBL Hemoglobin (chocolate agar) | VWR | 90000-662 | Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above |
| BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) | VWR | 90000-414 | Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates |
| Dissecting forceps, fine tip, curved | VWR | 82027-406 | |
| Self-sealing sterilization pouches | VWR | 89140-802 | |
| Gentamicin sulfate, 10 mg/ml | Lonza | 17-519Z | Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill |
References
- Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
- Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children. Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).
- Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells. Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).
- Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies. J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).
- Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium. Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).
- Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components. Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).
- Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin. Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).
- Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicology. 244, 66-76 (2008).
- Fahy, J. V., Dickey, M. D. Airway mucus function and dysfunction. N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).
- Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -. D. Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi. 359, 691-696 (2007).
