استخدام نموذج لوصف EpiAirway طويل الأجل المضيف الممرض التفاعلات
Summary
هذا الأسلوب يسمح توصيف البكتيرية تمديد التعاون مع EpiAirways الثقافة البشرية والجهاز التنفسي الأولية الأنسجة الطلائية نمت في واجهة الهواء السائل ، وهو ذات الصلة بيولوجيا<em> في المختبر</em> النموذج. ويمكن استخدام هذا النهج مع أي ميكروب التي قابلة للالمدى الطويل المشترك الثقافة.
Abstract
Nontypeable المستدمية النزلية (NTHi) هي تكييف الإنسان الجراثيم سلبية الغرام التي يمكن أن تسبب التهابات متكررة ومزمنة في الأغشية المخاطية التنفسية 1 ، 2. لدراسة الآليات التي من خلالها هذه الكائنات على البقاء على قيد الحياة وداخل أنسجة الجهاز التنفسي ، وهذا نموذج التي يمكن أن يؤديها بنجاح على المدى الطويل المشترك ثقافة البكتيريا والخلايا البشرية هو مطلوب. نستخدم الإنسان التنفسي الأنسجة الطلائية الأولية التي أثيرت في واجهة الهواء السائل ، نموذج EpiAirway (ماتيك ، آشلاند ، MA). هذه هي غير خلدت جيدا ومتباينة ، 3 الابعاد الأنسجة التي تحتوي على منعطفات ضيقة ، وخلايا مهدبة وnonciliated ، والخلايا التي تنتج القدح الميوسين ، والابقاء على القدرة على إنتاج السيتوكينات في الاستجابة للعدوى.
ويمكن استخدام هذا النموذج ذات الصلة بيولوجيا في المختبر من مجرى الهواء العلوي الإنسان في عدد من الطرق ، والهدف العام من هذا الأسلوب هو لأداء على المدى الطويل المشترك ثقافة الأنسجة EpiAirway مع NTHi وquantitate الخلية المرتبطة البكتيريا والمنضوية مع مرور الوقت . كذلك ، يمكن تحديد الإنتاج والميوسين ملف خلوى من المصابين المشترك الثقافات. يحسن هذا النهج على الأساليب الموجودة في العديد من البروتوكولات التي تستخدم الحالية مغمورة أحادي الطبقة أو Transwell الثقافات من الخلايا البشرية ، وهي ليست قادرة على دعم الالتهابات البكتيرية على مدى فترات طويلة 3. على سبيل المثال ، إذا كان الكائن الحي يمكن أن تتكرر في وسائل الإعلام الفوقية ، وهذا يمكن أن يؤدي إلى مستويات غير مقبولة من السمسة وفقدان الخلايا المضيفة والقت القبض على التجربة. نموذج EpiAirway يسمح توصيف التفاعلات المضيف الممرض على المدى الطويل. علاوة على ذلك ، منذ المصدر للEpiAirway أمر طبيعي الإنسان الرغامى خلايا الشعب الهوائية بدلا من خط خلده ، كل واحدة على تمثيل ممتاز من الإنسان التنفسي العلوي الفعلية أنسجة المسالك ، سواء من حيث الهيكل وظيفة 4.
لهذا الأسلوب ، الأنسجة EpiAirway مفطوم الخروج من المركبات المضادة للميكروبات ومكافحة الفطريات لمدة 2 أيام قبل التسليم ، ويتم تنفيذ كافة الإجراءات في إطار المضادات الحيوية خالية من الشروط. هذا يتطلب اعتبارات خاصة ، حيث يتم استخدام كل من البكتيريا والأنسجة البشرية الأساسية للسلامة الأحيائية في الحكومة نفسها ، وشارك في تربيتها لفترات طويلة.
Protocol
Discussion
هذا الأسلوب يسمح للتحقيق في التفاعلات المضيف الممرض على المدى الطويل في خلفية ذات الصلة بيولوجيا من الأنسجة الابتدائية التنفسي للإنسان في واجهة الهواء السائل. هنا استخدمنا NTHi كما يصيب الكائن ، ولكن يمكن كميا أي تفاعل البكتيريا التي لا يدخل السمسة غير مقبولة على مر ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر باتريك هايدن (ماتيك) لإجراء مناقشات مفيدة ، وروبرت سميث وبيري ليبي للعلوم الصحية للجامعة جورجيا EM المهارات الخاصة بهم. وقد تم تمويل هذه الدراسة من خلال منحة NIDCD DC010187 إلى DAD
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue# | Comments |
|---|---|---|---|
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium | Lonza | 17-513Q | |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium | Lonza | 17-515Q | |
| EpiAirway antibiotic-free tissues | MatTek | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway antibiotic-free maintenance media | MatTek | AIR-100-MM-ABF | Supplied with kit |
| 10X phosphate-buffered saline solution | EMD | 6506 | Dilute to 1X before use |
| Gelatin | JT Baker | 2124-01 | Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave |
| Difco GC Medium Base (chocolate agar) | VWR | 90002-016 | Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C |
| BBL Hemoglobin (chocolate agar) | VWR | 90000-662 | Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above |
| BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) | VWR | 90000-414 | Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates |
| Dissecting forceps, fine tip, curved | VWR | 82027-406 | |
| Self-sealing sterilization pouches | VWR | 89140-802 | |
| Gentamicin sulfate, 10 mg/ml | Lonza | 17-519Z | Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill |
References
- Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
- Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children. Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).
- Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells. Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).
- Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies. J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).
- Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium. Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).
- Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components. Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).
- Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin. Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).
- Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicology. 244, 66-76 (2008).
- Fahy, J. V., Dickey, M. D. Airway mucus function and dysfunction. N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).
- Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -. D. Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi. 359, 691-696 (2007).
