長期宿主 - 病原体相互作用を特徴付けるためのEpiAirwayモデルの利用
Summary
このメソッドは、EpiAirways、気液界面で成長させた初代ヒト呼吸器上皮組織、生物学的に関連するとの共培養の拡張細菌の特性評価を可能に<em> in vitroで</em>モデル。アプローチは、長期の共培養に従順であるすべての微生物を使用することができます。
Abstract
2、分類不可能なインフルエンザ菌 （NTHi）は呼吸器粘膜1の再発や慢性感染症を引き起こす可能性が人間に適応したグラム陰性細菌である。これらの生物が呼吸組織上および内部に生存するメカニズムを研究するために、細菌やヒトの細胞の成功を長期的な共培養を行うことができるモデルが必要となります。我々は、気液界面、EpiAirwayモデル（マテック、アッシュランド、マサチューセッツ州）に上げ、一次ヒト呼吸器上皮組織を使用してください。これらは、タイトジャンクション、繊毛とnonciliated細胞、ムチンを産生、および感染症に反応してサイトカインを産生する能力を保持する杯細胞を含む非不死化、高分化型、3次元の組織です。
人間の上気道の in vitroモデルで 、この生物学的に関連は多くの方法で使用することができ、この方法の全体的な目標は、時間をかけてNTHiと定量細胞に関連すると内面化細菌とEpiAirway組織の長期的な共培養を行うことです。 。同様に、共培養感染のムチン産生とサイトカインプロファイルを決定することができます。このアプローチは、多くの現在のプロトコルで、既存の方法を改良したものを長時間3を介して細菌感染をサポートすることができるではないヒト細胞の水中単層またはトランスウェル培養を、使用してください。生物が覆っている媒体に複製することができるたとえば、、これは実験を逮捕、細胞毒性と宿主細胞の損失の許容できないレベルになることがあります。 EpiAirwayモデルは長期的な宿主 – 病原体相互作用の特性評価が可能になります。さらに、EpiAirwayのソースではなく不死のラインよりも、正常なヒト気管気管支細胞であるため、それぞれの構造でと機能4の両方に実際の人間の上気道組織の優れた表現です。
この方法の場合は、EpiAirway組織は、配信前に2日間の抗微生物及び抗真菌化合物の離乳オフ、およびすべてのプロシージャは抗生物質フリーの条件下で行われています。細菌および初代ヒト組織の両方が同一の生物学的安全キャビネット内で使用されている、と長時間共培養しているので、これは、特別な考慮が必要となる。
Protocol
Discussion
このメソッドは、空気 – 液体界面における原発性ヒト呼吸器組織の生物学的に関連する背景に長期的な宿主 – 病原体相互作用の調査が可能になります。ここでは、感染微生物としてNTHiを使用しましたが、時間をかけて許容細胞毒性を導入しない任意の細菌の相互作用は、この方法で定量することができる。 EpiAirwayモデルはまた、ウイルス、薬物、または化学物質に影響を与える人間の上気?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は彼らのEMのスキルのために有用な議論のためのパトリックヘイデン（マテック）、そしてロバートスミスとジョージア健康科学大学のリビーペリーに感謝の意を表します。この研究は、DADにNIDCD助成金DC010187によって賄われていた
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue# | Comments |
|---|---|---|---|
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium | Lonza | 17-513Q | |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium | Lonza | 17-515Q | |
| EpiAirway antibiotic-free tissues | MatTek | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway antibiotic-free maintenance media | MatTek | AIR-100-MM-ABF | Supplied with kit |
| 10X phosphate-buffered saline solution | EMD | 6506 | Dilute to 1X before use |
| Gelatin | JT Baker | 2124-01 | Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave |
| Difco GC Medium Base (chocolate agar) | VWR | 90002-016 | Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C |
| BBL Hemoglobin (chocolate agar) | VWR | 90000-662 | Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above |
| BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) | VWR | 90000-414 | Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates |
| Dissecting forceps, fine tip, curved | VWR | 82027-406 | |
| Self-sealing sterilization pouches | VWR | 89140-802 | |
| Gentamicin sulfate, 10 mg/ml | Lonza | 17-519Z | Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill |
References
- Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
- Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children. Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).
- Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells. Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).
- Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies. J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).
- Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium. Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).
- Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components. Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).
- Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin. Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).
- Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicology. 244, 66-76 (2008).
- Fahy, J. V., Dickey, M. D. Airway mucus function and dysfunction. N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).
- Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -. D. Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi. 359, 691-696 (2007).
