Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Knochenverlust nach Rückenmarksverletzungen mit Novel, In vivo Methodology

1. Maus Rückenmark durchtrennt Modell Erwachsene, männlich, C57BL6 Mäusen (ca. 20-25 g) werden betäubt mit einer Kombination von Ketamin (200 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). Alle chirurgischen Eingriffe sind in einem institutionellen, IACUC genehmigten OP unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Einmal tief narkotisiert, ist das Fell des Rückens getrimmt mit elektrischen Haarschneidemaschinen. Die rasierten Rücken wird zuerst geschrubbt mit einer Jod-Lösung von 70% Ethanol gefolgt. Vor der ersten Einschnitt ist der Bereich des Rückens zu eingeschnitten werden zunächst mit einem Lokalanästhetikum (Marcain) in einer Konzentration von (0,25%, <1ml/kg) infiltriert, um postoperative Schmerzen zu minimieren. Mit einer kleinen Schere, eine kleine Öffnung in die Haut rund um den L2-Bereich gemacht. Diese Öffnung ist mit dem gleichen Satz von Schere erweitert, die sich in Längsrichtung auf die T2-Bereich. Die Ränder der Haut sind dann auseinander über die Verwendung von Bulldogklemmen statt. Micro-Scheren werden dann verwendet,klare Muskelgewebe aus dem dorsalen Lamina bei Brust-Stufe 8 (T8). T8 identifiziert als in Kuh-und Wrathall (1998) 10 beschrieben werden. Kurz gesagt, kann T13 durch seine dorsal Dornfortsatz identifiziert werden. Mit einem Paar # 5 Dumont Pinzetten, kann die letzte Rippe palpiert / identifiziert werden und zurück zu T8 gezählt. Einmal gelöscht, Knochen Rongeure werden verwendet, um eine dorsale Laminektomie bei T8 durchzuführen. Vollständige Spinal Durchtrennung Läsion: Sobald das Rückenmark bei T8 ausgesetzt, eine zusätzliche Reihe von sterilisierten Micro-Scheren werden verwendet, um das Rückenmark in der Ebene senkrecht zur Längsachse des Kabels sever unter einem Operationsmikroskop. Wir verwenden # 5 Dumont Pinzette vorsichtig aus dem einen Pol des Rückenmarks, die Vollständigkeit der Läsion zu bestätigen. Nach Durchtrennung der Wirbelsäule, ein kleines Stück sterile Gelschaum in steriler Kochsalzlösung getränkt (0,9%) wird vorsichtig in die Läsion Hohlraum zur Blutstillung zu fördern platziert. Ein zusätzliches Stück Gelschaum wird dann über die exponierte Spin platziertal Kabel. Die Haut wird dann mit einer sterilen, Edelstahl-chirurgische Klammern geschlossen. Themen werden dann in ihre Käfige zurück, platziert auf einem Papiertuch, um eine Aspiration von Einstreu zu verhindern und wärmte mit einem Heizkissen für einen Zeitraum von ca. 12 Stunden. Themen sind auch mit Hydrogel-Packs (ClearH2O) und Futtertabletten auf dem Boden ihrer Käfige in der frühen Wiederherstellung zur Verfügung gestellt. Verletzte Personen sind in der Lage, den Zugang Essen / Wasser in ihre Käfige einmal aus der Narkose erholt. Alle verletzten Personen erhalten zweimal täglich manuelle Blase Evakuierungen (bei ca. 12 Stunden) unter Verwendung einer Modifikation des manuellen Verfahrens von Crede für die Dauer der Studie (40 Tage). Verletzte Mäuse auch mit zweimal täglich intraperitoneale Injektionen von 0,9% iger Kochsalzlösung für drei Tage (0,5 cc) bereitgestellt, um zu halten Feuchtigkeit, und zweimal tägliche Injektionen von dem Opiat Buprenorphin (0,05 mg / kg) zur Kontrolle postoperativer Schmerzen für einen Zeitraum von 5 Tage. Wenn Tiere zeigen Anzeichen of Schmerzen nach der ersten 5 Tage Zeit, sie würden zusätzliche Buprenorphin (0,05 mg / kg) täglich zu empfangen, bis Anzeichen von Schmerzen (eingeschränkter Mobilität, gebeugt Statur, das Versagen der Bräutigam, Stimmgebung bei der Handhabung) gelöst sind. 2. Longitudinal Beurteilung der Knochendichte mit dem IVIS Lumina XR auf der gleichen Kohorte von spinal-durchtrennt Mäusen Beginnend am Tag 10 post-SCI-und Weiterbildung in Intervallen von 10 Tagen bis zum Tag 40, untersuchten wir rechts und links Oberschenkel-und Schienbein in lebenden, narkotisierten Patienten (Durchtrennung SCI und unverletzt Alter passenden Kontrollen). Am Tag des Scannens, wurden die Probanden in ihre Käfige aus der Institution Vivarium Bereich in den Raum, in dem die Caliper IVIS Lumina XR untergebracht übertragen. Alle Fächer werden dann narkotisiert mit dem gleichen Ketamin / Xylazin Cocktail zuvor bei der Lieferung von SCI verwendet. Dieser Cocktail garantiert einen Zustand der Betäubung für einen Zeitraum von 1 bis 1,5 Stunden; ausreichend für die Dauer der scannIng. Verfahren. Die Ermittler initialisiert die Lumina XR-Gerät und ermöglicht die interne Kamera auf Betriebstemperatur (-90 ° C) (~ 10 Minuten) zu erreichen. Einmal betäubt, ist das Thema (Durchtrennung oder Kontrolle) vorsichtig auf das Tier-Plattform innerhalb der Lumina XR platziert. Ein hoher Vergrößerung Objektiv ist in das Gerät eingeführt, um den Fokus auf beiden Femur-und Tibia-Regionen (Sehfeld 2.4X2.4cm mit hoher Vergrößerung Objektiv) zu ermöglichen. Wenn das Motiv nicht ordnungsgemäß außerhalb des Sichtfeldes positioniert ist, wird die Tür geöffnet und das Thema neu positioniert, bis die linke oder rechte Hinterbein zentriert ist (siehe Abbildung 2a für die richtige Platzierung der hinteren Gliedmaßen). Einmal richtig positioniert ist, kann die X-ray-Funktion ausgeführt werden. Treffen Sie eine Auswahl aus der Energie der Dropdown-Liste für Tiere (Living unterliegen, 35 Kv 100uA, gefiltert X-Rays) Sobald das Tier in der richtigen Position, aktivieren Sie die X-ray-Funktion von Check-Kennzeichnung X-Ray in denBedienfeld. Erwerben Sie die X-ray image. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Ober-und Unterschenkels sichtbar sind (siehe Abbildung 2b). Raw-Bilddaten automatisch auf der Festplatte gespeichert. Vertreter. TIFF-Dateien werden ebenfalls gespeichert. Die Maus wird dann zu seiner eigenen Käfig zurück und durfte unter Prüfarztobservation erholen. Der Prozess wird dann mit dem nächsten Mausklick wiederholt. Hinweis: The Living Image Software zeigt verwandelt Röntgenbilder standardmäßig. Um rohe Röntgenbilder, entfernen Sie das Häkchen neben dem X-Ray Absorption in den Korrekturen / Filtering Tools. Wenn der X-ray-Daten für die Absorption wurde korrigiert, können Sie relativ Knochendichte durch den Vergleich der Signalintensitäten der Messung ROIs auszuwerten. Die ROI-Intensität mit zunehmender Gewebedichte. 3. Bildanalyse von IVIS X-ray-Scans Öffnen Sie die Software durch Doppelklick auf das Lebende Abbild Icon. Laden Sie ein X-ray Bild, indem Sie die <strong> Schaltfläche Durchsuchen. In dem Dialogfeld, das angezeigt wird, wählen Sie den Ordner von Interesse und klicken Sie auf OK. The Living Bild-Browser zeigt die ausgewählten Daten zusammen mit der Benutzer-ID, Label-Information, und die Kamera Informationen zur Konfiguration. Zum Öffnen von Daten, führen Sie einen der folgenden Schritte aus: Doppelklicken Sie auf die Datenreihe, mit der rechten Maustaste auf die Daten ein und wählen Sie laden im Kontextmenü auf, wählen die Datenzeile und klicken Sie auf Laden, oder doppelklicken Sie auf das Bild. Die Bild-und Werkzeug-Palette angezeigt werden. Offene Daten sind in grün im Browser hervorgehoben. Klicken Sie auf ROI-Tools in der Tool-Palette. In der ROI-Tools, wählen Measurement ROI aus der Dropdown-Liste. So laden Sie die 3 ROI ist in diesem Experiment verwendet, klicken Sie auf das quadratische Symbol und laden 3 Quadraten. Mit einem Lineal, messen Sie die Länge des Oberschenkelknochens. Passen Sie die Länge von zwei der Quadrate zu 1 / 8 th der gesamten Femurlänge werden. Passen Sie die Breite der beiden Quadrate werden die insgesamt Femurlänge 1/24th. Mit Ihrer Lineal, messen 1 / 8 th der Abstand vom proximalen Ende des Oberschenkelknochens und verorten den Platz, so dass es innerhalb des Femur zentriert ist. Situate zweiten Platz, so dass es 1/4th der gesamten Femurlänge vom distalen Ende des Femurs (Abb. 3) liegt. Diese ROI können sowohl proximalen und distalen Femur Regionen zu messen. Mit dem Lineal, messen Sie die Länge der Tibia. Passen Sie die Länge des dritten Platzes zu 1 / 8 th der gesamten Tibia-Länge sein. Passen Sie die Breite um 1 / 30 th der gesamten Tibia-Länge. Situate dem Platz so, dass zentriert ist und 1 / 8 th der gesamten Länge des Schienbeins Abstand vom proximalen Ende des Schienbeins (siehe Abbildung 3). Klicken Sie auf den Messen Symbol (ein Bleistift und Lineal). Der ROI Intensitätsmessungen erscheinen im Röntgenbild und die ROI-Messungen Tabelle erscheint. Export dieser Tabelle to die gewünschte Position als. csv-Datei. Damit können Sie die Tabelle mit Excel zu öffnen. Wiederholen Sie dies mit all Ihren gespeicherten Bilder. Konsolidieren Sie alle Ihre Daten auf einem Excel-Arbeitsblatt. Statistische Signifikanz wurde mittels Student t-Test entweder mit Microsoft Excel oder SigmaPlot 11,0-Software (Systat Software) bestimmt. 4. Post-mortem-Analyse der Knochendichte: Nach der Übernahme der endgültigen Längs-X-ray-Scan innerhalb der IVIS Lumina XR sind Mäuse anschließend tief narkotisiert mit Beuthanasia (75 mg Pentobarbital / kg). Sobald tiefe Narkose erreicht ist, werden die Mäuse transkardial mit vereisten kalten perfundierten Phosphat-gepufferte mit heparain (40 mg / Liter) Kochsalzlösung exsanguinate. Sobald entblutet, Verbrauchssteuern sowohl Oberschenkel. Achten Sie besonders darauf, so viel Weichgewebe wie möglich zu entfernen, denn diese erwiesen hat Dichtemessungen 11 beeinflussen. Wickeln Sie den Oberschenkel mit Wasser getränkten Gaze und an einem-20C bis Sie bereit sind, diese zu analysieren sind. 5. DXA-Analyse mit einem Hologic QDR 4000 Knochen Densitometer Thaw Gaze getränkt Oberschenkel-und Transfer zum Knochen Densitometer suite. Kalibrieren Sie das Gerät gemäß dem Protokoll des Herstellers; sicherzustellen, dass die BMC-und BMD-Werte innerhalb der zulässigen Grenzen liegen. Legen Sie eine Messing Kollimator in der Maschine. Dies ermöglicht dem Benutzer, um die Größe und den Winkel der Röntgenstrahl Begrenzung auf ein bestimmtes Ziel zu konzentrieren. Tauchen Sie die aufgetauten Femur in eine Petrischale mit Wasser (Kondylen auf der linken Seite, mit dem Femur parallel zum Bett), und positionieren Sie es nur um das Recht des Lasers gefüllt. Geben Sie eine Biografie (einen aussagekräftigen Titel, die zur Kennzeichnung von Tieren Informationen, Behandlung, etc. gehören) für den Oberschenkelknochen Sie sind im Begriff, zu scannen. Geben Sie Scan aus der Auswahl-Menü, und wählen Sie dann RegionA hallo-res. Geben Sie Ihre Scan-Parameter: Ein Scan-Bereich von 2 x 0,7489 Zoll, mit 0,01 Zoll Zeilenabstand und 0,00499 Zoll Punkt-Auflösung. Hinweis: Überwachen Sie den Scan, während es im Gange ist. Da die Röntgenstrahlung Rasterabtastungen der Probe, zu überwachen, um sicherzustellen, dass genügend Wasser in der Kammer vollständig zu bedecken den Knochen Probe. Geben Sie Analyze unter den Analysis-Auswahl-Menü. Folgen Sie den Anweisungen, um das gesamte Femur als ROI zu markieren. Ein Bericht Seite kommen mit der berechneten BMC (Gramm) und BMD (g / cm 2). Wiederholen Sie diese Schritte, um die verbleibenden Oberschenkel zu analysieren. Konsolidieren Sie alle Ihre Daten auf einem Excel-Arbeitsblatt und statistische Analysen (t-Test). 6. Repräsentative Ergebnisse: Die relative Knochendichte Verlust von einer Maus Tibia und Femur nach Verletzungen des Rückenmarks, wenn auf naive Mäuse im Vergleich nachweisbar ist mit der obigen Methode. Es gibt einen nachweisbaren signifikanten Abnahme der Knochendichte nachnur 10 Tage (12%, p <0,0005), mit bis zu 15% Knochendichte Verlust auf 40 Tage (p <0,0005, Abbildung 4). Knochendichte Verlust in den Oberschenkelknochen wurde bei 40 Tagen nach der Verletzung (7% sinken, p <0,05, Abb. 5) beobachtet. Diese Ergebnisse liefern Beweise für die Verwendung von nicht-invasiven Röntgen-Bildgebung für die Längs-Beobachtung der Knochendichte zu ändern, nachdem Rückenmarksverletzungen. Um einen Vergleich der Wirksamkeit dieser Methode auf, was derzeit verfügbar; analysierten wir die ausgeschnittenen Oberschenkelknochen von diesen Mäusen 40 Tage nach der Verletzung mit DXA Bildgebung. Eine Darstellung der Datenausgabe kann in Abbildung 6 zu sehen. Wir fanden, dass es einen signifikanten Verlust an Knochendichte in der SCI-Mäuse im Vergleich zu naiv (12% sinken, p <0,05, Abb. 7). Knochendichte nicht wesentlich geändert, aber einen ähnlichen Trend (Abbildung 8). Diese Ergebnisse sind vergleichbar mit denen in der Literatur gefunden; Picard et al beobachteten eine Rückgang von 13,5% (p <0,001) in BMC, aber keine signifikanten decrLeichtigkeit in BMD (Picard 2008). Abbildung 1. Experimental Timeline. Abbildung 2 Vertreter Ausrichtung des linken Hinterbein-Schenkel:. A) Foto und b) x-ray. Abbildung 3. ROI Dimensionen und Orientierung innerhalb der Regionen des proximalen Femur und Tibia. Abbildung 4. Knochendichte Verlust nach SCI in der proximalen Tibia 10, 20, 30 und 40 Tage nach der Verletzung (n = 5) im Vergleich zu gleichaltrigen Naiven (n = 5). Fehlerbalken stellen SEM, ** p <0,005, *** p <0,0005. <strong> Abbildung 5. Knochendichte Verlust nach SCI im proximalen Femur 10, 20, 30 und 40 Tage nach der Verletzung (n = 5) im Vergleich zu gleichaltrigen Naiven (n = 5). Fehlerbalken stellen SEM; * p <0,05. Abbildung 6. Knochendichte Verlust nach SCI im distalen Femur 10, 20, 30 und 40 Tage nach der Verletzung (n = 5) im Vergleich zu gleichaltrigen naiven Kontrollen (n = 5). Fehlerbalken stellen SEM; * p <0,01 bis 0,05; ** p <0,001-0,01; *** p <0,0001 bis 0,001; **** p <0,0001. Abbildung 7. Representative Bild von DXA-Daten zeigen, BMC und BMD-Ausgang. Abbildung 8. DXA Analyse der Knochendichte (Gramm) in den Oberschenkelknochen von SCI-Mäusen 40 Tage nach der Verletzung (n = 5) vs gleichaltrigen Naiven (n = 5).Fehlerbalken stellen SEM; * p <0,05. Abbildung 9. DXA-Analyse der Knochendichte (mg / cm 2) in den Oberschenkelknochen von SCI-Mäusen 40 Tage nach der Verletzung (n = 5) vs gleichaltrigen Naiven (n = 5). Fehlerbalken stellen SEM; kein signifikanter Unterschied.