Evaluación longitudinal de ratón posteriores pérdida de masa ósea del miembro después de una lesión de la médula espinal utilizando Novel, En vivo Metodología

1. Espinal de ratón modelo de corte transversal Adulto, hombre, C57BL6 ratones (aproximadamente 20-25 g) son anestesiados utilizando una combinación de ketamina (200 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). Todos los procedimientos quirúrgicos se realizan en un entorno institucional, IACUC aprobado por quirófano bajo condiciones estériles. Una vez que profundamente anestesiados, la piel de la espalda se recorta el uso de podadoras eléctricas. La parte trasera es la primera afeitada limpia con una solución de yodo seguida de etanol al 70%. Antes de la incisión inicial, el área de la parte de atrás de una incisión por primera vez se infiltraron con un anestésico local (bupivacaína) a una concentración de (0,25%, <1ml/kg) para minimizar el dolor post-quirúrgico. Utilizando unas tijeras pequeñas, una pequeña abertura en la piel alrededor de la zona de L2. Esta apertura se amplía con el mismo conjunto de tijeras, que se extiende longitudinalmente a la zona de T2. Los bordes de la piel luego se mantienen separadas mediante el uso de bulldogs. Micro-tijeras se utilizanpara eliminar el tejido muscular de la lámina dorsal vertebral a nivel torácico 8 (T8). T8 se puede identificar como se describe en Kuh y Wrathall (1998) 10. En pocas palabras, T13 se pueden identificar por su apófisis espinosa dorsal. Con un par de pinzas Dumont n º 5, de la última costilla se puede palpar / identificados y contados de nuevo a T8. Una vez aprobados, gubias hueso se utiliza para realizar una laminectomía dorsal en T8. Lesión completa transección espinal: Una vez que la médula espinal está expuesta a T8, un conjunto adicional de esterilizar micro-tijeras se usan para cortar la médula espinal en el plano perpendicular al eje longitudinal de la médula con un microscopio quirúrgico. Usamos # 5 pinzas Dumont para levantar suavemente uno de los polos de la médula espinal para confirmar la integridad de la lesión. Después de la transección espinal, un pequeño pedazo de espuma de gel estéril, empapada en solución salina estéril (0,9%) se coloca cuidadosamente en la cavidad de la lesión para favorecer la hemostasia. Una pieza adicional de espuma de gel se coloca sobre el giro expuestosal cable. La piel se cierra con estéril, de acero inoxidable con grapas quirúrgicas. Los sujetos se regresan a sus jaulas, colocado sobre una toalla de papel para evitar la aspiración de material de cama y se calienta con una almohadilla eléctrica por un período de aproximadamente 12 horas. Los sujetos también se les proporciona paquetes de hidrogel (ClearH2O) y pellets de comida en el piso de sus jaulas durante la recuperación temprana. Sujetos perjudicados son capaces de acceder a los alimentos / agua en sus jaulas, una vez recuperado de la anestesia. Todos los sujetos lesionados reciban evacuación manual de dos veces al día la vejiga (aproximadamente a intervalos de 12 horas) mediante una modificación del método manual de Crede para la duración del estudio (40 días). Los ratones lesionados también reciben inyecciones dos veces al día por vía intraperitoneal de 0,9% durante tres días (0,5 cc) para ayudar a mantener la hidratación, y dos inyecciones diarias de la buprenorfina opiáceos (0,05 mg / kg) para controlar el dolor post-quirúrgico por un período de 5 días. Si los animales presentan signos of dolor después del período inicial de cinco, que iban a recibir buprenorfina adicionales (0,05 mg / kg) al día hasta que los signos de dolor (movilidad reducida, la estatura encorvada, la falta de novio, la vocalización, cuando se manipula) han resuelto. 2. La evaluación longitudinal de la densidad ósea mediante el IVIS Lumina XR en la misma cohorte de ratones medular seccionado- A partir del día 10 post-SCI y continuando a intervalos de 10 días hasta el día 40, se evaluó el fémur derecho e izquierdo y tibia en la vida, los sujetos anestesiados (SCI transección y la sana controles emparejados por edad). En el día de la exploración, los sujetos fueron trasladados en sus jaulas de la zona de Vivero de la Institución a la sala en la que el Caliper IVIS Lumina XR se encuentra. Todos los sujetos se anestesiaron con el mismo ketamina / xilazina cóctel utilizado anteriormente en la entrega de SCI. Este cóctel asegura un estado de anestesia durante un periodo de 1 a 1.5 horas, suficiente para la duración de la scannción del procedimiento. El investigador inicia el dispositivo de Lumina XR y permite que la cámara interna para alcanzar la temperatura de funcionamiento (-90 ° C) (~ 10 minutos). Una vez anestesiado, el sujeto (transección o control) se coloca suavemente en la plataforma de los animales en la XR Lumina. Una lente de gran aumento se inserta en el dispositivo para permitir que se centran tanto en el fémur y la tibia regiones (Campo de visión 2.4X2.4cm con lente de gran aumento). Si el sujeto no está bien colocado fuera del campo de vista, la puerta se abre y el tema volverá a colocar hasta la extremidad posterior derecha o izquierda se centra (ver Figura 2a para su correcta colocación de la extremidad posterior). Una vez colocado correctamente, la función de rayos X puede ser ejecutado. Hacer una selección de la Energía en la lista desplegable adecuado de los animales (sujeto vivo, 35 Kv 100uA, filtra los rayos X) Una vez que el animal se encuentra en la posición correcta, active la función de rayos X por medio de cheque, marca X-Ray en elpanel de control. Adquirir la imagen de rayos-X. Asegúrese de que todo el fémur y la tibia son visibles (ver Figura 2b). Los datos brutos de imagen se guarda automáticamente en el disco duro. Representante. TIFF también se guardan. El ratón es devuelto a su jaula y se les permite recuperarse bajo la observación del investigador. El proceso se repite con el ratón al lado. Nota: El software de imagen viva muestra transformado imágenes de rayos X por defecto. Para mostrar la cruda imágenes de rayos X, quite la marca de verificación junto a absorción de rayos X en las correcciones / Las herramientas de filtrado. Cuando los datos de rayos-X ha sido corregido en la absorción, se puede evaluar la densidad ósea relativa mediante la comparación de la intensidad de la señal de medición de ROI. La intensidad de retorno de la inversión aumenta con la densidad de los tejidos aumentando. 3. Análisis de imágenes de IVIS de rayos X escanea Abra el software haciendo doble clic sobre el icono de imagen de vida. Cargar una imagen de rayos X, haga clic en el <stRong> en el botón Examinar. En el cuadro de diálogo que aparece, seleccione la carpeta de interés y haga clic en Aceptar. El navegador de viva imagen muestra los datos seleccionados, junto con el ID de usuario, información de la etiqueta y la información de configuración de la cámara. Para abrir los datos, realice una de las siguientes: Haga doble clic en la fila de datos, haga clic en el nombre de carga de datos y seleccionar en el menú contextual, seleccione la fila de datos y haga clic en Cargar, o doble clic en la miniatura. La paleta de la imagen y la herramienta se muestran. Datos abiertos se resalta en verde en el navegador. Haga clic en Herramientas de retorno de la inversión en la paleta de herramientas. En las herramientas de ROI, retorno de la inversión seleccione el tipo de medición de la lista desplegable. Para cargar el ROI 3 se utiliza en este experimento, haga clic en el icono de la plaza y la carga de 3 casillas. Con una regla, medir la longitud del fémur. Ajustar la longitud de dos de las plazas que se ª 1 / 8 de la longitud del fémur total de. Ajustar el ancho de estas dos plazas que se 1/24th la longitud del fémur total. Con la regla, medir 1 / 8 de la distancia desde el extremo proximal del fémur, y situar a la plaza para que se centra en el fémur. Situar a la segunda plaza para que quede 1/4o de la longitud del fémur total del extremo distal del fémur (Fig. 3). Estos de retorno de la inversión se puede utilizar para medir las regiones del fémur proximal y distal. Con la regla, medir la longitud de la tibia. Ajustar la longitud de la tercera plaza a ª 1 / 8 de la longitud de la tibia total. Ajustar el ancho y 1 / 30 ª de la longitud de la tibia total. Situar a la plaza para que esté centrado y 1 / 8 de la longitud total de la distancia de la tibia desde el extremo proximal de la tibia (ver Figura 3). Haga clic en el icono de la medida (un lápiz y una regla). Las mediciones de la intensidad de retorno de la inversión aparecen en la imagen de rayos X y aparece la tabla de mediciones de rendimiento de la inversión. Exportar esta tabla to la ubicación deseada en un archivo. csv. Esto le permitirá abrir la tabla con Excel. Repita este proceso con todas las de las imágenes guardadas. Consolidar todos los datos en una hoja Excel. La significación estadística se determinó a través de la t de Student prueba utilizando Microsoft Excel o SigmaPlot 11.0 de software (Software Systat). 4. Análisis post-mortem de la densidad ósea: Tras la adquisición de la final longitudinal de rayos X de exploración dentro de la XR IVIS Lumina, los ratones son posteriormente profundamente anestesiados con Beuthanasia (75 mg pentobarbital / kg). Una vez que la anestesia profunda se ha logrado, los ratones son transcardially perfundidos con helado frío tampón fosfato salino con heparain (40 mg / litro) a exsanguinate. Una vez desangrado, los impuestos especiales ambos fémures. Pagar un cuidado especial para eliminar los tejidos blandos tanto como sea posible, para ello se ha demostrado que afecta a 11 mediciones de la densidad. Envuelva los fémures con una gasa empapados en agua y almacenar en-20C hasta que esté listo para su análisis. 5. DXA Análisis utilizando un Hologic QDR 4000 Densitómetro Óseo Una gasa empapada en descongelar el fémur y la transferencia a la habitación ósea densitómetro. Calibrar el aparato de acuerdo con el protocolo del fabricante; asegurar que los valores de BMC y BMD dentro de los límites aceptables. Colocar un colimador de bronce en la máquina. Esto permite al usuario limitar el tamaño y el ángulo del haz de rayos X para centrarse en un objetivo específico. Sumerja el fémur descongelado en un plato de Petri llenas de agua (cóndilos a la izquierda, con el paralelo del fémur a la cama), y la posición justo a la derecha del láser. Escriba una biografía (un título descriptivo que incluye información de identificación de animales, tratamiento, etc) para el fémur que va a escanear. Entrar en el menú de exploración de las selecciones, a continuación, seleccione regiona alta resolución. Indique sus parámetros de análisis: Una exploración de la región 2 x 0,7489 pulgadas, con 0,01 interlineado pulgadas y resolución de punto 0,00499 pulgadas. Nota: Monitor de la exploración mientras está en curso. A medida que el haz de rayos X trama explora la muestra, el monitor para asegurarse de que hay suficiente agua en la cámara para cubrir completamente la muestra de hueso. Analizar entrar en el menú de selección de análisis. Siga las instrucciones para poner de relieve el fémur completo como un retorno de la inversión. Una página del informe se van a plantear con la calculada BMC (gramos) y la DMO (g / cm 2). Repita estos pasos para analizar los fémures restantes. Consolidar todos los datos en una hoja de Excel y el análisis estadístico (t-test). 6. Los resultados representativos: La pérdida de densidad ósea relativa de la tibia y el fémur de ratón después de una lesión de la médula espinal en comparación con los ratones ingenuo es detectable con el método anterior. Hay una disminución detectable significativamente la densidad ósea despuéssólo 10 días (12%, p <0,0005), con un máximo de 15% de pérdida de densidad ósea a los 40 días (p <0,0005, Figura 4). Pérdida de densidad ósea en el fémur se observó a 40 días después de la lesión (7% de disminución, p <0,05, Figura 5). Estos resultados proporcionan evidencias para el uso de no-invasivo imágenes de rayos X para la observación longitudinal de los cambios de la densidad ósea después de una lesión de la médula espinal. Con el fin de comparar la eficacia de este método a lo que es en la actualidad; se analizaron los fémures extirpado de estos ratones 40 días después de la lesión usando DXA imágenes. Una representación de la salida de datos se puede observar en la Figura 6. Hemos encontrado que hay una pérdida significativa de contenido mineral óseo en los ratones SCI en comparación con ingenua (12% de disminución, p <0,05, Figura 7). La densidad mineral ósea no cambió significativamente, pero siguió una tendencia similar (Figura 8). Estos resultados son similares a los encontrados en la literatura; Picard et al observaron una disminución del 13,5% (p <0,001) en la revista BMC, pero no significativa decrfacilidad en la DMO (Picard 2008). Figura 1. Cronología Experimental. Figura 2 orientación Representante de la izquierda patas traseras:. Una fotografía) y b) x-ray. Figura 3. Dimensiones retorno de la inversión y la orientación dentro de las regiones de la porción proximal del fémur y la tibia. Figura 4. La pérdida de densidad ósea después de la lesión en la tibia proximal 10, 20, 30 y 40 días después de la lesión (n = 5) en comparación con la misma edad ingenuos (n = 5). Las barras de error representan el SEM; ** p <0.005, *** p <0,0005. <stRong> Figura 5. La pérdida de hueso densidad después de la lesión en el fémur proximal 10, 20, 30 y 40 días después de la lesión (n = 5) en comparación con la misma edad ingenuos (n = 5). Las barras de error representan el SEM, * p <0,05. Figura 6. La pérdida de densidad ósea después de la lesión en el fémur distal días 10, 20, 30 y 40 después de la lesión (n = 5) en comparación con controles pareados por edad ingenua (n = 5). Las barras de error representan el SEM, * p <.01 a .05, ** p <0,001-0,01; *** p <0.0001-0.001, **** p <0,0001. Figura 7. Imagen representativa de los datos de DXA muestra BMC y la salida de DMO. Figura 8. DXA análisis de contenido mineral óseo (gramos) en los fémures de los ratones SCI 40 días después de la lesión (n = 5) vs la misma edad ingenuos (n = 5).Las barras de error representan el SEM, * p <0,05. Figura 9. DXA análisis de la densidad mineral ósea (mg / cm 2) en los fémures de los ratones después de la lesión SCI 40 días (n = 5) vs la misma edad ingenuos (n = 5). Las barras de error representan el SEM, no hubo diferencias significativas.