Longitudinale Evaluatie van de muis Hind Limb botverlies na ruggenmergletsel met behulp van nieuwe, In vivo Methodologie

1. Muis spinale doorsnijding model Volwassen, mannelijk, C57Bl6 muizen (ongeveer 20-25 g) worden verdoofd met behulp van een combinatie van ketamine (200 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg). Alle chirurgische ingrepen worden uitgevoerd in een Institutioneel, IACUC-goedgekeurde chirurgische suite onder steriele omstandigheden. Eenmaal diep onder narcose, is de vacht van de rug gesneden met behulp van elektrische tondeuse. De geschoren rug wordt eerst gewassen met een jodiumoplossing, gevolgd door 70% ethanol. Voorafgaand aan de eerste incisie, is het gebied van de rug te worden ingesneden eerste geïnfiltreerd met een plaatselijke verdoving (Marcaine) bij een concentratie van (0,25%, <1ml/kg) om postoperatieve pijn te minimaliseren. Met behulp van kleine schaar, is een kleine opening gemaakt in de huid rond de L2 gebied. Deze opening is uitgebreid met dezelfde set van de schaar, uitbreiding van lengterichting van de T2 gebied. De randen van de huid worden dan uit elkaar gehouden via het gebruik van de bulldog klemmen. Micro-schaar worden dan gebruiktduidelijke spierweefsel uit het dorsale ruggenmerg lamina op thoracale niveau 8 (T8). T8 kunnen worden geïdentificeerd, zoals beschreven in Kuh en Wrathall (1998) 10. Kortom, kan T13 worden geïdentificeerd door zijn dorsale processus spinosus. Met behulp van een paar # 5 Dumont tang, kan de laatste rib worden gepalpeerd / geïdentificeerd en geteld terug naar T8. Eenmaal gewist, bot Rongeurs worden gebruikt om een ​​dorsale laminectomie presteren op T8. Spinal volledige doorsnijding Laesie: Zodra het ruggenmerg wordt blootgesteld aan T8, een extra set van gesteriliseerde micro-schaar worden gebruikt om het ruggenmerg in het vlak loodrecht verbreken om de lange as van het koord onder een chirurgische microscoop. We maken gebruik van # 5 Dumont een tang om til een pool van het ruggenmerg naar de volledigheid van de laesie te bevestigen. Na de spinale transsectie, een klein stukje van steriele gelfoam, gedrenkt in steriele zoutoplossing (0,9%) is zorgvuldig geplaatst in de laesie holte hemostase te bevorderen. Een extra stuk van gelfoam wordt dan geplaatst over de blootliggende draaienal koord. De huid wordt dan gesloten met een steriele, roestvrij staal chirurgische nietjes. De onderwerpen zijn vervolgens terug naar hun huis kooien, geplaatst op een papieren handdoek om aspiratie van strooisel voorkomen en verwarmd met een verwarmingselement voor een periode van ongeveer 12 uur. De onderwerpen zijn ook voorzien van Hydrogel packs (ClearH2O) en voedsel pellets op de vloer van de kooien tijdens de vroege herstellen. Gewonde onderwerpen zijn in staat om toegang voedsel / water in hun eigen kooien eens hersteld van anesthesie. Alle gewonde patiënten krijgen twee keer per dag handmatig blaas evacuatie (op ongeveer 12 uur) met behulp van een modificatie van de handmatige methode van Crede voor de duur van de studie (40 dagen). Gewonde muizen zijn ook voorzien van tweemaal daags intraperitoneale injecties van 0,9% zoutoplossing gedurende drie dagen (0,5 cc) om te helpen hydratatie te behouden, en tweemaal daags injecties van de opiaat buprenorfine (0,05 mg / kg) tot post-operatieve pijn voor een periode van controle 5 dagen. Als dieren vertonen tekenen of pijn na de eerste periode van vijf dagen, dan zouden ze extra buprenorfine (0,05 mg / kg) per dag krijgen tot de tekenen van pijn (een beperkte mobiliteit, ineengedoken gestalte, niet te verzorgen, vocalisatie bij hantering) hebben opgelost. 2. Longitudinale beoordeling van de botdichtheid met behulp van de IVIS Lumina XR op dezelfde cohort van spinally-doorsneden muizen Beginnend op dag 10 na de SCI en voortgezet op 10 dagen met intervallen tot dag 40, onderzochten we rechts en links bovenbenen en tibiae in het leven, patiënten onder narcose (doorsnijding SCI en ongedeerd leeftijd gematchte controles). Op de dag van het scannen, kregen de proefpersonen overgebracht in hun huis kooien van de Instelling Vivarium gebied om de ruimte waarin de Caliper IVIS Lumina XR is gehuisvest. Alle onderwerpen worden dan verdoofd met behulp van dezelfde ketamine / xylazine cocktail eerder gebruikt in de levering van SCI. Deze cocktail zorgt voor een toestand van verdoving voor een periode van 1 tot 1,5 uur, voldoende voor de duur van de scannING procedure. De onderzoeker initialiseert de Lumina XR apparaat en kan de interne camera te bereiken operationele temperatuur (-90 ° C) (~ 10 minuten). Eenmaal verdoofd, is het onderwerp (doorsnijding of controle) voorzichtig op de dier-platform binnen de Lumina XR. Een hoge vergroting lens is ingevoegd in het apparaat te richten zodat zowel op dijbeen en scheenbeen regio's (Gezichtsveld 2.4X2.4cm met een sterk vergrotende lens). Als het onderwerp niet goed is gepositioneerd buiten het gezichtsveld, is de deur geopend en het onderwerp opnieuw gepositioneerd totdat de linker of rechter achterpoot ledematen in het midden (zie afbeelding 2a voor de juiste plaatsing van de achterste ledematen). Eens goed geplaatst is, kan de X-ray-functie worden uitgevoerd. Maak een selectie uit de Energy drop-down lijst geschikt voor diervoeding (Wonen onderwerp, 35 Kv 100uA, gefilterd X-stralen) Zodra het dier in de juiste positie, zodat de X-ray functie door check-markering X-Ray in debedieningspaneel. verwerven van de X-ray beeld. Zorg ervoor dat de gehele femur en de tibia te zien zijn (zie Figuur 2b). Ruwe beeld gegevens worden automatisch opgeslagen op de harde schijf. Vertegenwoordiger. TIFF-bestanden worden ook opgeslagen. De muis wordt dan weer in de kooi en laten herstellen onder onderzoeker observatie. Het proces wordt vervolgens herhaald met de volgende muis. Let op: The Living Image software toont getransformeerd X-ray beelden door standaard. Om te laten zien ruwe X-ray beelden, verwijdert u het vinkje naast de X-Ray Absorptie in het Correcties / Filtering tools. Wanneer de X-ray data is gecorrigeerd voor de absorptie, dan kunt u de relatieve dichtheid van het bot te evalueren door vergelijking van de signaal intensiteit van de meting ROI. De ROI intensiteit toeneemt met toenemende dichtheid van weefsel. 3. Beeldanalyse van IVIS X-ray scans Open de software door te dubbelklikken op het levende beeld Icoon. Laad een X-ray afbeelding door te klikken op de <strong> knop Bladeren. In het dialoogvenster dat verschijnt, selecteert u de map van rente en klik op OK. The Living Image browser toont de geselecteerde gegevens samen met de gebruikers-ID, het etiket informatie, en camera-configuratie-informatie. Voor het openen van gegevens, voert u een van de volgende: de gegevens rij Dubbelklik op de rechtermuisknop op de naam van data en selecteer Laden in het snelmenu, Selecteer de gegevens rij en klikt u op Laden, of Dubbelklik op de miniatuur. Het beeld en de Tool Palette worden weergegeven. Open data is gemarkeerd in het groen in de browser. Klik op de ROI Tools in de Tool Palette. In de ROI Tools, kies Meting ROI van de Type keuzelijst. Voor het laden van de drie ROI's gebruikt in dit experiment, klik op het vierkant pictogram en laden drie pleinen. Met behulp van een liniaal, meet de lengte van het dijbeen. Pas de lengte van twee van de kwadraten tot 1 / 8 ste van de totale femur lengte. Pas de breedte van deze twee pleinen aan de totale femur lengte 1/24e. Met uw heerser, maat 1 / 8 ste van de afstand van het proximale uiteinde van het dijbeen, en situeren het plein, zodat het is gecentreerd in het dijbeen. Situeren het tweede vierkant, zodat ligt 1/4e van de totale dijbeen lengte van het distale uiteinde van het femur (fig. 3). Deze ROI's kunnen worden gebruikt om zowel de proximale en distale femur regio's te meten. Met behulp van de heerser, meet de lengte van het scheenbeen. Pas de lengte van de derde vierkant tot 1 / 8 ste van de totale lengte tibia. Pas de breedte tot 1 / 30 ste van de totale lengte tibia. Situeren op het plein dus dat is gecentreerd en 1 / 8 ste van de totale lengte van de tibia afstand van het proximale uiteinde van de tibia (zie figuur 3). Klik op het icoontje Measure (een potlood en liniaal). De ROI intensiteit metingen verschijnen in de X-ray beeld en de ROI-metingen tafel verschijnt. Exporteer deze tabel to de gewenste locatie als een. csv-bestand. Dit zal u toelaten om de tabel in Excel te openen. Herhaal dit met al je opgeslagen foto's. Consolideer al uw gegevens naar een Excel-blad. Statistische significantie werd bepaald via de Student's t-test met behulp van Microsoft Excel of SigmaPlot 11,0 software (systat Software). 4. Post-mortem analyse van de botdichtheid: Na de overname van de uiteindelijke longitudinale X-ray scan binnen de IVIS Lumina XR, muizen worden vervolgens diep onder narcose gebracht met Beuthanasia (75 mg pentobarbital / kg). Zodra diepe narcose is bereikt, worden de muizen transcardially geperfuseerd met ijs-koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing met heparain (40 mg / liter) voor exsanguinate. Eenmaal exsanguinated, accijnzen beide bovenbenen. Besteed speciale zorg om zoveel mogelijk zacht weefsel te verwijderen als mogelijk, want dat is aangetoond dat metingen van de dichtheid 11 beïnvloeden. Wikkel de bovenbenen met water doordrenkte gaas en op te slaan-20C tot u klaar bent om ze te analyseren. 5. DXA analyse met behulp van een Hologic QDR 4000 Bone Densitometer Dooi gaas gedrenkt scheen-en transfer naar Bone Densitometer suite. Kalibreer de inrichting volgens protocol van de fabrikant, ervoor zorgen dat de BMC en BMD waarden vallen binnen de aanvaardbare grenzen. Plaats een koperen collimator in de machine. Hierdoor kan de gebruiker de grootte en de hoek van de X-stralen te beperken tot focus op een specifieke doelgroep. Dompel de ontdooide dijbeen in een petrischaal gevuld met water (knobbels aan de linkerkant, met het dijbeen parallel aan het bed), en plaats het gewoon aan de rechterkant van de laser. Voer een Biografie (een beschrijvende titel die de identificatie van dieren informatie, behandeling, enz. omvat) voor het dijbeen die u gaat scannen. Geef Scan van de Selecties Menu, selecteer dan regionA hi-res. Geef uw scanparameters: Een scanning regio van 2 x 0,7489 cm, met een 0,01 inch regelafstand en 0,00499 inch punt resolutie. Let op: Monitor de scan terwijl deze bezig is. Als de X-stralen raster scans van het monster, om te garanderen dat er voldoende water in de kamer volledig te dekken op het bot monster. Geef Analyseer onder de Analyse Selectie menu. Volg de aanwijzingen wijzen op het gehele femur als een ROI. Een rapport pagina zal komen met de berekende BMC (gram) en BMD (g / cm 2). Herhaal deze stappen om de resterende bovenbenen te analyseren. Consolideer al uw gegevens naar een Excel-blad en het uitvoeren van statistische analyses (t-test). 6. Representatieve resultaten: De relatieve botdichtheid verlies van een muis scheenbeen en dijbeen na dwarslaesie in vergelijking met de naïeve muizen is detecteerbaar met behulp van de bovengenoemde methode. Er is een aantoonbaar significante daling van de botdichtheid naslechts 10 dagen (12%, p <0,0005), met tot 15% verlies van botdichtheid bij 40 dagen (p <0,0005, figuur 4). Botdichtheid verlies in het dijbeen werd waargenomen bij 40 dagen na verwonding (7% dalen, p <0.05, figuur 5). Deze resultaten leveren het bewijs voor het gebruik van niet-invasieve x-ray imaging voor de longitudinale observatie van de botdichtheid te veranderen na ruggenmergletsel. Met het oog op de effectiviteit van deze methode tot wat momenteel beschikbaar is te vergelijken; we de weggesneden bovenbenen van deze muizen geanalyseerd 40 dagen na het letsel met behulp van DXA beeldvorming. Een weergave van de data-output is te zien in figuur 6. Wij vonden dat er een aanzienlijk verlies van bot mineraal gehalte in de SCI muizen in vergelijking met naïeve (12% daling, p <0.05, figuur 7). Botdichtheid veranderden niet significant, maar volgde een vergelijkbare trend (figuur 8). Deze resultaten zijn vergelijkbaar met die gevonden in de literatuur; Picard et al. zagen een afname van 13,5% (p <0,001) in BMC, maar geen significante decrgemak in BMD (Picard 2008). Figuur 1. Experimentele tijdlijn. Figuur 2 Vertegenwoordiger oriëntatie van links achterste ledematen:. A) foto en b) x-ray. Figuur 3. ROI afmetingen en oriëntatie binnen de regio's van de proximale femur en tibia. Figuur 4. Botdichtheid verlies na SCI in de proximale tibia 10, 20, 30 en 40 dagen na het letsel (n = 5) ten opzichte van vergelijkbare leeftijd Naives (n = 5). Foutbalken representeren SEM; ** p <0,005, *** p <0,0005. <strong> Figuur 5. botdichtheid verlies na SCI in het proximale femur 10, 20, 30 en 40 dagen na het letsel (n = 5) ten opzichte van vergelijkbare leeftijd Naives (n = 5). Foutbalken representeren SEM; * p <0,05. Figuur 6. Botdichtheid verlies na SCI in de distale femur 10, 20, 30 en 40 dagen na het letsel (n = 5) in vergelijking met leeftijd gematchte naïeve controlegroep (n = 5). Foutbalken representeren SEM; * p <0.01-0.05; ** p <0.001-0.01; *** p <0.0001-0.001; **** p <0,0001. Figuur 7. Representatief beeld van de DXA gegevens waaruit blijkt dat BMC en BMD output. Figuur 8. DXA analyse van het bot mineraal gehalte (gram) in de bovenbenen van SCI muizen 40 dagen na letsel (n = 5) versus leeftijd-gematchte Naives (n = 5).Foutbalken representeren SEM; * p <0,05. Figuur 9. DXA analyse van de bot mineraal dichtheid (mg / cm 2) in de bovenbenen van SCI muizen 40 dagen na letsel (n = 5) versus leeftijd-gematchte Naives (n = 5). Foutbalken representeren SEM; geen significant verschil.