小説を使用して、脊髄損傷後のマウス後肢の骨の損失の経時的評価、 in vivoで、方法論

1。マウス脊髄切断モデル大人、男性、C57BL6マウス（約20〜25 g）は、ケタミン（200 mg / kg）をとキシラジン（10 mg / kg）の組み合わせを使用して麻酔する。すべての外科手術は無菌条件下で機関、IACUCに承認された手術室で行われます。 一度深く麻酔、バックの毛を電気バリカンを使ってトリミングされます。剃毛背部は70％エタノールに続くヨウ素溶液との最初のスクラブです。 最初の切開の前に、切開する背面の面積は、最初の手術後の痛みを最小限に抑えるための濃度（0.25％、<1ml/kg）で局所麻酔薬（Marcaine）で浸潤されています。 小さなはさみを使用して、小さな開口部がL2の領域付近での皮膚で作られています。この開口部はT2エリアに長手方向に延びる、はさみの同じセットで展開されます。皮膚の縁は、その後ブルドッグクランプの使用を介して離れて開催されます。 マイクロシザー構造がその後使用されています胸椎レベル8（T8）で背側脊髄ラミナから筋肉組織をクリアに。クウとWrathall（1998）10に記載のT8を識別することができます。簡単に言えば、T13はその背棘突起によって識別することができます。 ＃5デュモンのピンセットを使用して、最後の肋骨は触知/識別とT8に戻ってカウントすることができます。一旦クリアされると、骨RongeursはT8で背側椎弓切除を実行するために使用されます。 完全脊髄切断の病変：いったん脊髄を滅菌マイクロシザーの追加セットが手術用顕微鏡下で脊髄の長軸に垂直な平面で脊髄を切断するために使用される、T8で公開されている。我々は穏やかに病変の完全性を確認するために脊髄の一方の極を持ち上げるために＃5デュモンの鉗子を使用してください。 脊髄切断に続いて、滅菌生理食塩水に浸した滅菌gelfoamの小片、（0.9％）を慎重に止血を促進するために病変空洞内に配置されます。 gelfoamの追加部分は、露出したスピンの上に配置されアルコード。皮膚を無菌、ステンレス製の外科用ステープルで閉じられます。被験者は、その後、自分のホームケージに戻した寝具の材料の吸引を防止するためにペーパータオルの上に置き、約12時間の期間のための加熱パッドで暖めています。被験者はまた、早期に回復中にケージの床の上にハイドロパック（ClearH2O）と食品ペレットと提供されています。負傷した被験者は自分のホームケージでの食品/水は、一度麻酔から回復にアクセスすることができます。 すべての負傷者の被験者は、試験期間（40日）のためのクレーデの手動方法の変更を使用して1日2回のマニュアル膀胱の避難を（約12時間間隔で）受け取る。 負傷したマウスは、の期間のための外科手術後の痛みを制御するためにも、アヘンのブプレノルフィンの水和を維持するために三日間のための0.9％生理食塩水（0.5 CC）の毎日二度腹腔内注射で提供される、1日2回注射（0.05 mg / kg体重）です。 5日間。動物はサインoを示す場合痛みの兆候（処理不自由、背を丸め身長、新郎への障害、発声が）解決するまで、最初の5日間の期間の後にfの痛みは、彼らが毎日追加ブプレノルフィン（0.05 mg / kg）を受け取ることになります。 2。脊髄- transectedマウスの同一コホートでIVISルミナXRを使用して、骨密度の長期的評価 10日目後SCIで始まり、40日まで10日間の間隔で継続し、我々は、生活の中で右と左大腿骨と脛骨を評価した麻酔の被験者（切除SCIと無傷年齢をマッチさせた対照）。 スキャンの日に、被験者はキャ​​リパーIVISルミナXRが収容される部屋に機関のビバリウムの領域から彼らのホームケージに移した。すべての被験者は、以前にSCIの配信で使用したのと同じケタミン/キシラジンカクテルを使用して麻酔する。このカクテルは、1〜1.5時間の期間のために麻酔の状態を保証します。scannの期間中、十分なここに示す操作手順。 調査官は、ルミナXRのデバイスを初期化して内部カメラが正常に動作温度（-90 ° C）（〜10分）に到達することができます。 かつて麻酔、被験者（切除または制御）が静かにルミナXR内で動物のプラットフォーム上に配置されます。高倍率のレンズは、大腿骨と脛骨の領域（高倍率レンズとビュー2.4X2.4cmのフィールド）の両方にフォーカスを可能にするデバイスに挿入されます。対象が不適切に視野の外に配置されている場合、ドアが開かれ、左または右後肢を中心にされるまで（後肢の適切な配置のための図2aを参照）、再配置対象。 一度適切に配置、X線の機能を実行することができる。 動物に適したエネルギーのドロップダウンリストから選択します（リビング主題、35 Kv値100uA、X線フィルタ処理） 動物が正しい位置にあれば、チェックイン時に、マーキングX線によるX線機能を有効にするコントロールパネルは。X線画像を取得 。全体の大腿骨と脛骨が（図2bを参照）表示されることを確認します。生の画像データは、自動的にハードドライブに保存されます。代表的。TIFFファイルも保存されます。マウスは、そのホームケージに戻され、捜査官の監視の下に回復するために許可されています。プロセスは、次のマウスを使って繰り返されます。 注：リビングイメージのソフトウェアは、デフォルトで変換されたX線画像が表示されます。生のX線画像を表示するには、修正/フィルタリングツールのX線吸収の横にチェックマークを外します。 X線のデータは吸収のために修正されているときには、測定のROIの信号強度を比較することによって相対的な骨密度を評価することができます。 ROIの強度が増加する組織の密度が増加する。 3。 IVIS X線スキャンの画像解析リビングイメージのアイコンをダブルクリックしてソフトウェアを開きます。 クリックして、X線像をロードする<st栄> [参照]ボタン。表示されるダイアログボックスで、関心のフォルダを選択し、[OK]をクリックします。リビングイメージのブラウザでは、選択したユーザーIDとともにデータ、ラベル情報、およびカメラの設定情報が表示されます。データを開くには、以下のいずれかの操作を行います：データ行をダブルクリックし、データの名前を右クリックし、ショートカットメニューの[ 読み込み]を選択し、データの行を選択して、Load をクリックするか、サムネイル ​​をダブルクリックします。画像とツールパレットが表示されます。開いているデータは、ブラウザの緑色で強調表示されます。 ツールパレットで、ROIツールをクリックしてください。 ROIツールで、Typeドロップダウンリストから選択測定ROI。この実験で用いる3のROIをロードするには、 正方形のアイコンをクリックして、3乗をロードする。 定規を使用して、大腿骨の長さを測定する。総大腿骨の長さの1 / 8 番目になる正方形の二つの長さを調整します。。総大腿骨の長さを1/24thされるこれら2つの四角形の幅を調整します。あなたの定規、測定1月8日大腿骨の近位端からの距離の目 、そしてそれは大腿骨の中央に配置されるように正方形を位置づけると。それは大腿骨の遠位端（図3）から総大腿骨の長さの4分の1にあるように、2番目の四角を位置づける。これらのROIのは、近位および遠位の両方大腿骨領域を測定するために使用することができます。 定規を用いて、脛骨の長さを測定する。合計脛骨の長さの1 / 8 番目であることが第三平方の長さを調整します。合計脛骨長さの1 / 30日に幅を調整します。正方形を位置づけるように中心に、1 / 8 番目の脛骨の近位端（図3参照）から脛骨の距離の合計の長されている。 測定アイコン（鉛筆と定規）をクリックしてください。 ROIの強度測定は、X線画像に表示され、ROIの測定値のテーブルが表示されます。このテーブルtをエクスポートする。csvファイルとして任意の場所をO。これは、Excelを使用してテーブルを開くことができます。 保存した画像のすべてでこれを繰り返します。 あるExcelシート上のすべてのデータを統合する。統計的有意性は、Microsoft ExcelまたはSigmaPlotの11.0ソフトウェア（SYSTATのソフトウェア）のいずれかを使用して学生のt -テストにより決定した。 4。骨密度の事後分析： IVISルミナXR内で最終的な縦のX線スキャンの買収に続いて、マウスはその後Beuthanasia（75mgのペントバルビタール/ kg）で深く麻酔する。一度深い麻酔が達成されている、マウスtranscardially氷冷リン酸緩衝血を抜くためにheparain（40 mg /リットル）と生理食塩水で灌流されています。 いったん放血、消費税の両方大腿骨。これは密度の測定値11を影響を与えることが示されているために、できるだけ多くの軟組織を除去するために特別な注意を払ってください。で水に浸したガーゼや店舗で大腿骨を包みます- 20Cは、それらを分析する準備が整うまで。 5。 Hologic QDR 4000骨密度測定装置を用いてDXA分析融解のガーゼに浸して大腿骨と骨密度測定装置のスイートへの転送。 製造業者のプロトコルに従って装置のキャリブレーション、BMCとBMD値が許容範囲内であることを確認してください。 マシンの真鍮のコリメータを配置。これにより、ユーザーは特定のターゲットに集中するX線ビームの大きさと角度を制限することができます。 沈める水（左顆、ベッドに大腿骨と平行）、とだけレーザーの右側に位置してで満たされたペトリ皿に解凍した大腿骨。 スキャンしようとしている大腿骨のための伝記 （動物の識別情報、治療、等を含むわかりやすいタイトルを）入力します。 選択メニューからスキャンを入力し、[regionA高解像度を選択します。あなたのスキャンパラメータを示している：0.01インチ行間隔と0.00499インチ点の分解能で、2 × 0.7489インチの領域をスキャンする。 注意：これは進行中にスキャンを監視する。 X線ビームラスターはサンプルをスキャンするように、完全に骨のサ​​ンプルをカバーするためにチャンバ内に十分な水があることを確認するために監視する。 分析の選択]メニューの下に分析入力してください。 ROIとして全体の大腿骨を強調するためにプロンプ​​トに従います。レポートページは、計算されたBMC（グラム）とBMD（GMS / cm 2）をしてくるだろう。 残りの大腿骨を分析するためにこれらのステップを繰り返します。 あるExcelシート上にすべてのデータを統合し、（t -検定）統計分析を行います。 6。代表的な結果： ナイーブなマウスと比較して、脊髄損傷後のマウスの脛骨と大腿骨の相対的な骨密度の低下は、上記の方法を用いて検出可能である。後の骨密度の検出可能な大幅な低下を起こすことがあります40日で最大15％の骨密度の低下（P <0.0005、図4）とわずか10日間（12％、P <0.0005）、。大腿骨の骨密度の低下は、40日後の傷害（7％減少、P <0.05、図5）で観察された。これらの結果は、脊髄損傷後の骨密度変化の長期的観察のための非侵襲的なX線イメージングを使用するための証拠を提供する。 現在利用可能なものへのこの方法の有効性を比較するために、我々は40日DXAイメージングを使用して負傷した後、これらのマウスの摘出した大腿骨を分析した。データ出力の表現は、図6で見ることができます。我々は（12％減少、P <0.05、図7）ナイーブと比較すると骨ミネラル含量の著しい損失がSCIのマウスではないことがわかった。骨密度は有意な変化が、同様の傾向（図8）に従うでしたしませんでした。これらの結果は、文学に見られるものと類似しています。ピカードらはBMCで13.5％減少した（P <0.001）が、有意なDECRを観察BMD（ピカード2008）に容易になります。 図1実験のタイムライン。 図2左後肢の代表者向き：。）写真とb）のX線。 図3。近位大腿骨と脛骨の地域内でのROIの大きさと向き。 年齢をマッチさせたnaives（N = 5）に比べて30〜40日負傷後の脛骨近位部10、20、（N = 5）におけるSCI後の図4。骨密度の低下。エラーバーはSEMを表す、** P <0.005、*** P <0.0005。 <st年齢をマッチさせたnaives（N = 5）に比べて30〜40日負傷後の近位大腿骨10のSCI後の栄>図5。骨密度の損失、20、（N = 5）。エラーバーはSEMを表す。* P <0.05。 図6。10、20、30、40日負傷後の遠位大腿骨におけるSCI後の骨密度の低下（N = 5）年齢をマッチさナイーブなコントロールと比較して（n = 5）の。エラーバーはSEMを表す。* P <0.01〜0.05、** P <0.001〜0.01、*** P <0.0001から0.001; **** P <0.0001。 図7。BMCとBMDの出力を示すDXAデータの代表的なイメージ。 図8。DXAのSCIマウスの大腿骨の骨塩量の分析（グラム）40日後の傷害（N = 5）対年齢をマッチさせたnaives（N = 5）。エラーバーはSEMを表す。* P <0.05。 図9。DXAのSCIマウスの大腿骨の骨密度の分析（mg / cm 2）を40日後の傷害（N = 5）対年齢をマッチさせたnaives（N = 5）。有意な差は、エラーバーはSEMを示す。