Avaliação longitudinal do rato Perda Hind Limb óssea após lesão medular usando Novel, In vivo Metodologia,

1. Rato modelo transecção da coluna vertebral Adultos, machos, C57BL6 ratos (aproximadamente 20-25 g) são anestesiados com uma combinação de quetamina (200 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Todos os procedimentos cirúrgicos são realizados em um Institucionais, suite IACUC-aprovado cirúrgica em condições estéreis. Uma vez anestesiados profundamente, a pele das costas é cortado usando cortadores elétricos. A parte de trás raspada é primeiro limpo com uma solução de iodo seguida de etanol 70%. Antes da incisão inicial, a área das costas a ser incisada é o primeiro infiltrado com um anestésico local (Marcaine) a uma concentração de (0,25%, <1ml/kg) para minimizar a dor pós-operatória. Com uma tesoura pequena, uma pequena abertura é feita na pele em torno da área de L2. Esta abertura é ampliada com o mesmo conjunto de tesouras, estendendo-se longitudinalmente para a área de T2. As bordas da pele são, então, realizada à parte através do uso de grampos bulldog. Micro-tesoura são então usadospara limpar o tecido muscular a partir da lâmina dorsal espinhal a nível torácico 8 (T8). T8 pode ser identificado como descrito no Kuh e Wrathall (1998) 10. Resumidamente, T13 pode ser identificado pelo seu processo espinhoso dorsal. Usando um par de fórceps # 5 Dumont, a última costela pode ser palpada / identificadas e contadas de volta para T8. Uma vez liberado, Rongeurs ossos são usados ​​para executar uma laminectomia dorsal em T8. Lesão Transecção completa da Coluna Vertebral: Uma vez que a medula espinhal é exposta em T8, um conjunto adicional de micro-tesoura esterilizada são usados ​​para cortar a medula espinhal no plano perpendicular ao eixo longitudinal do cabo sob um microscópio cirúrgico. Nós usamos uma pinça # 5 Dumont para levantar delicadamente um pólo da medula espinhal para confirmar a integridade da lesão. Após transecção da coluna vertebral, um pequeno pedaço de gelfoam estéril, embebida em solução salina estéril (0,9%) é cuidadosamente colocado na cavidade lesão para promover a hemostasia. Uma peça adicional de gelfoam é então colocado sobre o spin expostoscabo de al. A pele é então fechada com estéril, em aço inoxidável grampos cirúrgicos. Temas são, então, voltou para suas gaiolas de casa, colocado em uma toalha de papel para evitar a aspiração do material de cama e aquecido com uma almofada de aquecimento por um período de aproximadamente 12 horas. Assuntos também são fornecidos com pacotes de hidrogel (ClearH2O) e grãos de ração no chão de suas jaulas durante a recuperação precoce. Assuntos feridos são capazes de acesso a alimentos / água em suas gaiolas de casa uma vez recuperado da anestesia. Todos os indivíduos feridos recebem duas vezes por dia evacuações bexiga manual (em aproximadamente 12 horas), utilizando uma modificação do método manual de Crede para a duração do estudo (40 dias). Camundongos feridos também são fornecidos com duas vezes por dia injeções intraperitoneal de 0,9% por três dias (0,5 cc) para ajudar a manter a hidratação, e duas vezes injeções diárias da buprenorfina opiáceos (0,05 mg / kg) para controlar a dor pós-operatória por um período de 5 dias. Se os animais apresentam sinais of dor após o período inicial de cinco dias, eles receberiam adicional buprenorfina (0,05 mg / kg) por dia até que os sinais de dor (mobilidade reduzida, estatura arqueada, a incapacidade de vocalização noivo, quando manuseados) ter resolvido. 2. Avaliação longitudinal da densidade óssea utilizando o IVIS Lumina XR sobre o mesmo grupo de subaracnóidea-transeccionados ratos Início no dia 10 pós-SCI e continuando em intervalos de 10 dias até o dia 40, foram avaliados fêmures direito e esquerdo e tíbias na vida, os indivíduos anestesiados (transecção SCI e ileso controles pareados por idade). No dia da varredura, os indivíduos foram transferidos em suas gaiolas de casa da área da Instituição Biotério para a sala em que a Caliper IVIS Lumina XR está alojado. Todos os indivíduos são, então, anestesiados com o coquetel de cetamina / xilazina mesmo utilizado anteriormente na entrega de SCI. Este cocktail garante um estado de anestesia por um período de 1 a 1,5 horas; suficiente para a duração do espiaprocedimento ing. O investigador inicializa o dispositivo Lumina XR e permite que a câmera interna para atingir a temperatura de funcionamento (-90 ° C) (~ 10 minutos). Uma vez anestesiados, o sujeito (transecção ou controle) é suavemente colocado na plataforma dos animais na XR Lumina. Uma lente de alta ampliação é inserido no dispositivo para permitir que o foco de ambos fêmur e da tíbia regiões (Campo de visão 2.4X2.4cm com ampliação alta lente). Se o assunto for indevidamente posicionado fora do campo de visão, a porta é aberta eo tema re-posicionado até a perna esquerda ou traseira direita está centrado (Veja Figura 2a para a colocação adequada do membro posterior). Uma vez posicionada corretamente, a função de raios-X pode ser executado. Fazer uma seleção a partir da Energia lista drop-down adequado para Animal (sujeito vivo, 35 Kv 100uA, filtrado X-Rays) Uma vez que o animal está na posição correta, ativar o recurso de raios-X por X-Ray check-marcação napainel de controle. Adquirir a imagem de raios-X. Certifique-se que o fêmur ea tíbia inteira são visíveis (ver Figura 2b). Dados de imagem raw é salvo automaticamente para o disco rígido. Representante. TIFF arquivos também são salvos. O mouse é, então, retornou à sua gaiola e permitiu recuperar sob observação investigador. O processo é então repetido com o mouse em seguida. Nota: O software exibe imagem viva transformou radiografias por padrão. Para mostrar-prima radiografias, remover a marca de seleção ao lado de X-Ray Absorção na Correcções / As ferramentas de filtragem. Quando os dados de raios-X foi corrigido para a absorção, você pode avaliar a densidade óssea relativa, comparando a intensidade de sinal de ROIs de medição. A intensidade aumenta com o ROI densidade do tecido aumentando. 3. Análise de imagem de raios-X IVIS scans Abra o software, clicando duas vezes no ícone da imagem Living. Carregar uma imagem de raios-X, clicando no <strong> botão Browse. Na caixa de diálogo que aparece, selecione a pasta de interesse e clique em OK. O navegador exibe a imagem viva de dados selecionado, juntamente com o ID do usuário, informações do rótulo e informações de configuração da câmera. Para abrir os dados, faça o seguinte: Dê um duplo clique na linha de dados, direito do mouse no nome de dados e selecione Carregar no menu de atalho, selecione a linha de dados e clique em Load, ou duplo clique na miniatura. Paleta de imagem e ferramentas são exibidos. Dados abertos é destaque em verde no navegador. Clique em Ferramentas ROI na Paleta Tool. Nas ferramentas ROI, selecione ROI Medição do tipo drop-down list. Para carregar o ROI 3 é usado neste experimento, clique no ícone quadrado e carregar 3 quadrados. Usando uma régua, medir o comprimento do fêmur. Ajustar o comprimento de dois dos quadrados a serem º 08/01 do comprimento fêmur total. Ajustar a largura dessas duas praças de ser 1/24th o comprimento do fêmur total. Com a sua régua, meça º 08/01 da distância entre a extremidade proximal do fêmur, e situar a praça para que seja centrado no fêmur. Situar o segundo quadrado de modo que ela se encontra 1/4th do comprimento fêmur total da extremidade distal do fêmur (Fig. 3). Estes ROI pode ser usado para medir as regiões do fêmur proximal e distal. Usando a régua, medir o comprimento da tíbia. Ajustar o comprimento do terceiro quadrado a serem º 08/01 do comprimento total da tíbia. Ajustar a largura de 1 / 30 º do comprimento total da tíbia. Situar o quadrado de modo que é centrado e 08/01 º o comprimento total da distância a partir do final da tíbia proximal da tíbia (ver Figura 3). Clique no ícone Medida (um lápis e régua). As medições de intensidade ROI aparecem na imagem de raios-X eo ROI tabela medições aparece. Export esta tabela to seu local desejado como um arquivo csv.. Isto permitirá que você para abrir a tabela usando o Excel. Repita este procedimento com todas as suas imagens salvas. Consolidar todos os seus dados para uma folha excel. Significância estatística foi determinada através de teste t de Student, utilizando o Microsoft Excel ou 11,0 SigmaPlot software (Software Systat). 4. Post-mortem análise da densidade óssea: Após a aquisição da final longitudinal X-ray scan dentro do Lumina IVIS XR, os ratos são posteriormente profundamente anestesiados com Beuthanasia (75 mg pentobarbital / kg). Uma vez que a anestesia profunda foi alcançado, os ratos são transcardially perfundidos com gelado-frio tampão fosfato com heparain (40 mg / litro) para desangrar. Uma vez que sangrar, impostos ambos fêmures. Preste atenção especial para remover o máximo possível de tecido mole, por isso tem sido demonstrado que afetam medições de densidade 11. Enrole os fêmures com gaze embebida de água e armazenar em-20C até que esteja pronto para analisá-los. 5. DXA Análise usando um densitômetro Hologic QDR 4000 óssea Gaze encharcada de descongelar o fémur ea transferência para conjunto densitômetro ósseo. Calibrar o aparelho de acordo com o protocolo do fabricante; garantir que os valores BMC e BMD estar dentro dos limites aceitáveis. Coloque um colimador de bronze na máquina. Isso permite ao usuário limitar o tamanho eo ângulo do feixe de raios X para se concentrar em um alvo específico. Submergir o fêmur descongelado em uma placa de Petri com água (côndilos para a esquerda, com o fêmur paralelamente à cama), e posicioná-lo logo à direita do laser. Digite uma Biografia (um título descritivo que inclui informações de identificação dos animais, tratamento, etc) para o fêmur você está prestes a digitalização. Digite Digitalização a partir do Menu de Seleções, em seguida, selecione regionalização oi-res. Indicam os parâmetros de digitalização: A varredura da região de 2 x 0,7489 polegadas, com espaçamento de linha 0,01 polegadas e resolução de 0,00499 ponto polegadas. Nota: Monitorar o scan enquanto ele está em andamento. À medida que o feixe de raios X raster scans da amostra, monitor para garantir que não há água suficiente na câmara para cobrir completamente a amostra de osso. Analisar entrar no menu de seleção de análise. Siga as instruções para destacar o fêmur inteiro como um ROI. A página do relatório virá com o BMC calculado (gramas) e DMO (gms / cm 2). Repita essas etapas para analisar os fêmures restantes. Consolidar todos os seus dados para uma folha excel e análise estatística (t-test). 6. Resultados representativos: A perda de densidade relativa de um osso da tíbia e do fêmur do rato após a lesão medular quando comparado com camundongos ingênuos é detectável usando o método acima. Há uma diminuição significativa detectáveis ​​na densidade óssea apósapenas 10 dias (12%, p <0,0005), com até 15% perda de densidade óssea em 40 dias (p <0,0005, Figura 4). Perda de densidade óssea no fêmur foi observada em 40 dias após a lesão (diminuição de 7%, p <0,05, Figura 5). Estes resultados fornecem evidências para o uso de recursos não-invasivos de imagem de raios-x para a observação longitudinal de mudança de densidade óssea após lesão medular. A fim de comparar a eficácia deste método para o que está atualmente disponível; analisamos os fêmures excisadas desses ratos 40 dias após a lesão usando DXA imagem. Uma representação da saída de dados pode ser visto na Figura 6. Descobrimos que houve uma significativa perda de conteúdo mineral ósseo nos ratos SCI quando comparado com naïve (12% de redução, p <0,05, Figura 7). Densidade mineral óssea não se alterou significativamente, mas seguiu uma tendência semelhante (Figura 8). Estes resultados são semelhantes aos encontrados na literatura; Picard et al observaram uma diminuição de 13,5% (p <0,001) no BMC, mas não decr significativafacilidade em BMD (Picard 2008). Figura 1. Timeline Experimental. Figura 2 orientação Representante do membro posterior esquerdo:. Uma fotografia) e b) x-ray. Figura 3. ROI dimensões e orientação nas regiões do fêmur proximal e tíbia. Figura 4. Perda de densidade óssea após a LM na tíbia proximal 10, 20, 30 e 40 dias após a lesão (n = 5) em comparação com pareados por idade naives (n = 5). Barras de erro representam SEM; ** p <0,005, *** p <0,0005. <strong> Figura 5. óssea perda de densidade após a LM no fêmur proximal 10, 20, 30 e 40 dias após a lesão (n = 5) em comparação com pareados por idade naives (n = 5). Barras de erro representam SEM; * p <0,05. Figura 6. Perda de densidade óssea após a LM no fêmur distal dias 10, 20, 30 e 40 após a lesão (n = 5) em comparação com controles pareados por idade naïve (n = 5). Barras de erro representam SEM; * p <0,01-0,05; ** p <0,001-0,01; *** p <0,0001-,001; **** p <0,0001. Figura 7. Imagem representativa de dados DXA mostrando BMC e saída de BMD. Figura 8. DXA análise do conteúdo mineral ósseo (gramas) nos fêmures de camundongos SCI 40 dias pós-lesão (n = 5) versus pareados por idade naives (n = 5).Barras de erro representam SEM; * p <0,05. Figura 9. DXA análise da densidade mineral óssea (mg / cm 2) nos fêmures de camundongos SCI 40 dias após a lesão (n = 5) versus pareados por idade naives (n = 5). Barras de erro representam SEM, sem diferença significativa.