Summary

鼠标应用结扎Peyer氏修补肠袢含量评价M细胞的细菌吸收

Published: December 17, 2011
doi:

Summary

在一个专门的卵泡相关Peyer氏斑上皮M细胞在肠道相关淋巴组织的粘膜免疫监视中发挥的重要作用。在这里,我们描述了细菌transcytosis M细胞的评价方法<em>在体内</em>。这种方法提供了一种方法,以了解在免疫系统中的M -细胞功能。

Abstract

我们的肠道内居住的共生细菌的数量巨大。对胃肠道的黏膜表面不断暴露给他们,并偶尔病原体。肠道相关淋巴组织(GALT)为诱导黏膜免疫反应,这些微生物1,2中发挥了关键作用。要启动黏膜免疫反应,粘膜抗原必须运从肠腔整个组织,如Peyer氏斑淋巴滤泡的上皮屏障。这介导的抗原transcytosis是由专门的上皮M细胞3, 4。 M细胞是非典型的上皮细胞,积极吞噬大分子物质和微生物。 M细胞与树突状细胞(DCs)和巨噬细胞,靶抗原降解的溶酶体,主要transcytose内在抗原。这种积极通过M细胞的大分子transcytosis提供抗原的根本组织淋巴滤泡D是认为启动抗原特异性黏膜免疫反应的关键。然而,促进M细胞抗原摄取的分子机制在很大程度上是未知的。我们曾报道,糖蛋白2(GP2),特别是肠之间的M细胞的根尖质膜上表示,作为一个transcytotic受体的共生和致病肠杆菌的一个集,包括大肠杆菌和沙门氏菌血清型鼠伤寒沙门氏菌(鼠伤寒沙门氏菌),通过承认FimH,细菌外膜5菌毛类型的组成部分,我。在这里,我们提出了一个鼠标Peyer氏修补肠袢的检测,以评估M细胞的细菌摄取的应用方法。这个方法是鼠标肠袢先前所描述的6,7含量的改进版本。改进的要点如下:1。异氟醚被用作麻醉剂。 2。约1厘米结扎肠循环includING Peyer氏补丁成立。 3。 M细胞的细菌荧光标记的荧光标记试剂或过度表达的荧光蛋白,如绿色荧光蛋白(GFP)。 4。 M细胞相关的卵泡上皮覆盖Peyer氏补丁与反GP2抗体检测整个安装immunostainig。 5。荧光共聚焦显微镜分析观察M细胞的细菌transcytosis。小鼠Peyer氏补丁肠袢实验可以提供答案,什么样的共生或transcytosed M细胞的致病细菌,并可能导致我们了解如何通过M细胞刺激粘膜免疫系统的分子机制。

Protocol

1。细菌细胞的制备摆放着数甘油荧光的细菌(如绿色荧光蛋白表达的鼠伤寒沙门氏菌)的LB琼脂平板,含100μg / ml的氨苄青霉素。 文化从单菌落LB琼脂2毫升的新的LB培养基中过夜。 添加0.5毫升细菌培养,直到在600 nm的光密度达到1.0至4.5毫升的新的LB培养基孵育。 收获的细菌细胞,离心(3000 XG,5分钟,4℃)。 弃上清,5.0毫升的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗?…

Discussion

结扎Peyer氏菌悬液的补丁的孵化时间通常为1小时观察到M细胞的细菌掺入。在4小时孵化的情况下,细菌往往检测Peyer氏斑的T细胞区。由于蒸发异氟醚吸入麻醉小鼠保持稳定,结扎Peyer氏菌悬液的补丁的孵化时间可延长至观察T细胞Peyer氏补丁区移动的细菌。这个实验的重要的一点是要小心,不要划伤血管结扎肠道时。在不使用GFP表达的细菌的情况下,我们也可以选择使用商业荧光标记试剂荧光标…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

作者想感谢所有欧洲投资银行的成员,为开发这一技术。这项研究得到了部分科研优先领域“交通膜”(议员)和感染现象“黑客帝国”(KH),青年科学家(SF和KH),科研(何的格兰特在援助)和“细胞内物流”(何)从教育部,文化,体育,科学和技术日本,创新领域的科学研究。

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
LB Agar Ampicillin-
100
SIGMA L5667  
Cy3 mono-Reactive
Dye Pack
GE Healthcare PA23001  
Alexa Fluor 350
carboxylic acid,
succinimidyl ester
Invitrogen A10168  
Inhalation anesthesia
apparatus
Shinano Seisakusho SN-487  
Fixation and
Permeabilization
Solution
BD 554722  
Anti mouse
Glycoprotein 2
antibody
MBL D278-3 200-fold dilution (5μg/ml)
Goat Anti-Rat IgG,
F(ab’)2 fragment
specific
Jackson
ImmunoResearch
112-505-006 200-fold dilution (20μg/ml)
Alexa Fluor 633
Phalloidin
Molecular Probes A22284 50-fold dilution
Confocal laser
scanning microscope
Leica Microsystems DMIRE2  
DeltaVision
Restoration
deconvolution
microscope
Applied Precision DeltaVision Core  

References

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Cite This Article
Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225, doi:10.3791/3225 (2011).

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