Summary

Application d'une souris ligaturés Assay Peyer Patch anse intestinale pour évaluer absorption par les cellules bactériennes M

Published: December 17, 2011
doi:

Summary

Cellules M spécialisées dans un follicule associée épithélium couvrant les plaques de Peyer jouer un rôle important pour l'immunosurveillance des muqueuses dans l'intestin du tissu lymphoïde associé. Ici, nous avons décrit la méthode d'évaluation de transcytose bactérienne par les cellules M<em> In vivo</em>. Cette méthode fournit une méthode pour comprendre la fonction des cellules M dans le système immunitaire.

Abstract

L'intérieur de notre intestin est habité avec un nombre énorme de bactéries commensales. La surface de la muqueuse du tractus gastro-intestinal est continuellement exposé à eux et occasionnellement à des agents pathogènes. Le tissu lymphoïde associé intestin (GALT) jouent un rôle clé pour l'induction de la réponse immunitaire muqueuse de ces microbes 1, 2. Pour initier la réponse immunitaire muqueuse, les antigènes des muqueuses doivent être transportés de la lumière intestinale à travers la barrière épithéliale dans les follicules lymphoïdes organisés tels que les plaques de Peyer. Cette transcytose antigène est médiée par des cellules spécialisées épithéliales M 3, 4. Cellules M sont atypiques des cellules épithéliales qui ont activement phagocyter macromolécules et les microbes. Contrairement aux cellules dendritiques (CD) et les macrophages, les antigènes cibles pour la dégradation des lysosomes, les cellules M transcytose essentiellement des antigènes internalisés. Cette transcytose macromoléculaires vigoureuse à travers les cellules M délivre antigène aux sous-jacente a organisé une follicules lymphoïdesD est considérée comme essentielle pour initier antigène spécifique la réponse immunitaire muqueuse. Cependant, les mécanismes moléculaires favorisant cette absorption d'antigène par les cellules M sont largement inconnus. Nous avons précédemment rapporté que la glycoprotéine 2 (GP2), spécifiquement exprimé sur la membrane plasmique apicale des cellules M des entérocytes, sert de récepteur transcytotiques pour un sous-ensemble de commensaux et entérobactéries pathogènes, dont Escherichia coli et Salmonella enterica sérotype Typhimurium (S. Typhimurium ), en reconnaissant FimH, un composant de type I pili sur la membrane bactérienne externe 5. Ici, nous présentons une méthode pour l'application de doser un Peyer souris correctif anse intestinale afin d'évaluer l'absorption par les cellules bactériennes M. Cette méthode est une version améliorée du test en boucle intestinale de souris précédemment décrites 6, 7. Les points sont améliorés comme suit: 1. L'isoflurane a été utilisé comme un agent anesthésique. 2. Environ 1 cm ligaturé y anse intestinalePatch ING Peyer a été mis en place. 3. Les bactéries absorbées par les cellules M ont été marquées par fluorescence par le réactif de marquage par fluorescence ou par surexpression de la protéine fluorescente comme la protéine fluorescente verte (GFP). 4. Cellules M dans l'épithélium du follicule associée couvrant les plaques de Peyer ont été détectées par l'ensemble de montage immunostainig avec Gp2 anticorps anti. 5. Fluorescent transcytose bactérienne par les cellules M ont été observées par l'analyse microscopique confocale. Le dosage de Peyer souris correctif anse intestinale pourrait fournir la réponse quel genre de bactéries pathogènes ou commensales transcytosed par les cellules M, et peut nous amener à comprendre le mécanisme moléculaire de la façon de stimuler le système immunitaire muqueux à travers les cellules M.

Protocol

1. Préparation des cellules bactériennes Glycérol Streak stockés bactéries fluorescentes (GFP, comme exprimant S. Typhimurium) sur une plaque de gélose LB contenant 100 ug / ml d'ampicilline. Culture d'une seule colonie d'agar LB nuit dans 2 ml de milieu LB nouvelles. Ajouter 0,5 ml de culture bactérienne à 4,5 ml de milieu LB et incuber de nouvelles jusqu'à ce densité optique de 1,0 à 600 nm est atteint. Récolte des cellules bactériennes par…

Discussion

Le temps d'incubation du patch ligaturé Peyer avec suspension bactérienne est habituellement pendant 1 heure pour observer l'incorporation dans les cellules bactériennes M. Dans le cas de 4 h d'incubation, les bactéries sont souvent détectées dans la zone de cellules T des plaques de Peyer. Comme l'anesthésie par inhalation d'isoflurane vaporisée pourrait garder les souris stable, le temps d'incubation de plaques de Peyer ligaturé avec suspension bactérienne est extensible à obse…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier tous les membres de la BEI pour développer cette technique. Cette recherche a été financée en partie par Grant-in-Aid pour la recherche scientifique sur les domaines prioritaires "Trafic membranaire» (HO), et «Matrice des phénomènes infectieux" (KH), les jeunes scientifiques (SF et KH), et de la Recherche Scientifique (HO ), et de la recherche scientifique sur les domaines innovants "Logistique intracellulaire" (HO), du ministère de l'Éducation, Culture, Sports, Science et Technologie du Japon.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
LB Agar Ampicillin-
100
SIGMA L5667  
Cy3 mono-Reactive
Dye Pack
GE Healthcare PA23001  
Alexa Fluor 350
carboxylic acid,
succinimidyl ester
Invitrogen A10168  
Inhalation anesthesia
apparatus
Shinano Seisakusho SN-487  
Fixation and
Permeabilization
Solution
BD 554722  
Anti mouse
Glycoprotein 2
antibody
MBL D278-3 200-fold dilution (5μg/ml)
Goat Anti-Rat IgG,
F(ab’)2 fragment
specific
Jackson
ImmunoResearch
112-505-006 200-fold dilution (20μg/ml)
Alexa Fluor 633
Phalloidin
Molecular Probes A22284 50-fold dilution
Confocal laser
scanning microscope
Leica Microsystems DMIRE2  
DeltaVision
Restoration
deconvolution
microscope
Applied Precision DeltaVision Core  

References

  1. Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).
  2. Hapfelmeier, S. Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Science. 328, 1705-1709 (2010).
  3. Owen, R. L., Jones, A. L. Epithelial cell specialization within human Peyer’s patches: an ultrastructural study of intestinal lymphoid follicles. Gastroenterology. 66, 189-203 (1974).
  4. Neutra, M. R., Mantis, N. J., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissues. Nat. Immunol. 2, 1004-1009 (2001).
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Cite This Article
Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225, doi:10.3791/3225 (2011).

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