יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M
Summary
בתאי האפיתל M זקיק הקשורים התמחה כיסוי טלאים של Peyer לשחק תפקיד חשוב עבור immunosurveillance הרירית ברקמת המעי הקשורים הלימפה. כאן אנו תיאר את שיטת הערכה transcytosis חיידקי ידי תאים M<em> In vivo</em>. שיטה זו מספקת שיטה להבין M-תא לתפקד במערכת החיסונית.
Abstract
החלק הפנימי של המעי שלנו מאוכלס עם מספר עצום של חיידקים commensal. פני הרירית של מערכת העיכול חשופה ברציפות אליהם מדי פעם כדי פתוגנים. רקמת מעי הקשורים הלימפה (Galt) לשחק תפקיד מפתח לזירוז של התגובה החיסונית ברירית אלה החיידקים 1, 2. כדי ליזום את התגובה החיסונית ברירית, אנטיגנים הרירית חייב להיות מועבר מן לומן המעיים על פני המכשול אפיתל לתוך זקיקי הלימפה מאורגן כמו טלאים של Peyer. Transcytosis אנטיגן זה מתווך על ידי תאים מיוחדים M אפיתל 3, 4. תאים M הם תאים אפיתל טיפוסיות כי פעיל phagocytose מקרומולקולות חיידקים. שלא כמו תאים דנדריטים (DCS) וכן מקרופאגים, אנטיגנים אשר היעד lysosomes של השפלה, תאים M בעיקר transcytose אנטיגנים הפנימו. זה transcytosis macromolecular נמרץ באמצעות תאים M מספק אנטיגן אל זקיקי הלימפה הבסיסית מאורגןד הוא האמין להיות חיוני ליזום אנטיגן ספציפי התגובה החיסונית ברירית. עם זאת, המנגנונים המולקולריים בקידום זה ספיגת אנטיגן על ידי תאים M אינם ידועים ברובם. יש לנו דיווח בעבר כי גליקופרוטאין 2 (Gp2), הביע במפורש על הממברנה פלזמה apical של תאים M בין enterocytes, משמש לרצפטור transcytotic עבור משנה של commensal ו פתוגניים enterobacteria, כולל coli Escherichia ו סלמונלה enterica serovar Typhimurium (ס Typhimurium ), על ידי הכרה FimH, רכיב של סוג אני פילי על הממברנה החיצונית חיידקי 5. כאן, אנו מציגים שיטה ליישום התיקון assay Peyer של העכבר לולאת המעי להעריך את ספיגת חיידקים על ידי תאים ז. שיטה זו היא גרסה משופרת של assay עכבר לולאת המעי שתואר לעיל 6, 7. נקודות לשיפור הן כדלקמן: 1. Isoflurane שימש כסוכן הרדמה. 2. כ 1 ס"מ ligated includ לולאת המעיתיקון ing של Peyer הוקם. 3. חיידקים נלקח על ידי תאים M היו שכותרתו fluorescently ידי מגיב תיוג או על ידי חלבון פלואורסצנטי overexpressing ניאון כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). 4. בתאי האפיתל M זקיק הקשורים מכסה תיקון של Peyer התגלו על ידי כל הר immunostainig עם נוגדן אנטי Gp2. 5. Transcytosis פלורסנט חיידקי ידי תאים M נצפו על ידי ניתוח מיקרוסקופי confocal. מעיים המדבקה Peyer של העכבר assay לולאה יכול לספק את התשובה איזה סוג של commensal או חיידקים פתוגניים transcytosed ידי תאים M, ועלולה לגרום לנו להבין את המנגנון המולקולרי של איך לגרות את המערכת החיסונית ברירית באמצעות תאים ז.
Protocol
Discussion
זמן הדגירה של תיקון Peyer של ligated עם השעיה חיידקית היא בדרך כלל עבור שעות 1 כדי לבחון את שילוב חיידקים לתאי M. במקרה של דגירה 4 שעות, חיידקים מזוהים לעתים קרובות באזור תא T של טלאים של Peyer. כמו הרדמה מתאדה נשימתית isoflurane יכול לשמור על עכברים יציב, זמן הדגירה של תיקון Peyer של li…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לכל חברי EIB לפיתוח טכניקה זו. מחקר זה מומן בחלקו על ידי מענק סיוע-in-למחקר מדעי על אזורי עדיפות "התנועה ממברנה" (HO), ו "המטריקס של תופעות זיהומיות" (קרן היסוד), מדענים צעירים (SF ו KH), ואת המחקר המדעי (HO ), וכן על תחומי מחקר מדעי חדשני "לוגיסטיקה תאיים" (HO), ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה של יפן.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| LB Agar Ampicillin- 100 |
SIGMA | L5667 | |
| Cy3 mono-Reactive Dye Pack |
GE Healthcare | PA23001 | |
| Alexa Fluor 350 carboxylic acid, succinimidyl ester |
Invitrogen | A10168 | |
| Inhalation anesthesia apparatus |
Shinano Seisakusho | SN-487 | |
| Fixation and Permeabilization Solution |
BD | 554722 | |
| Anti mouse Glycoprotein 2 antibody |
MBL | D278-3 | 200-fold dilution (5μg/ml) |
| Goat Anti-Rat IgG, F(ab’)2 fragment specific |
Jackson ImmunoResearch |
112-505-006 | 200-fold dilution (20μg/ml) |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin |
Molecular Probes | A22284 | 50-fold dilution |
| Confocal laser scanning microscope |
Leica Microsystems | DMIRE2 | |
| DeltaVision Restoration deconvolution microscope |
Applied Precision | DeltaVision Core |
References
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).
- Hapfelmeier, S. Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Science. 328, 1705-1709 (2010).
- Owen, R. L., Jones, A. L. Epithelial cell specialization within human Peyer’s patches: an ultrastructural study of intestinal lymphoid follicles. Gastroenterology. 66, 189-203 (1974).
- Neutra, M. R., Mantis, N. J., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissues. Nat. Immunol. 2, 1004-1009 (2001).
- Hase, K. Uptake through glycoprotein 2 of FimH(+) bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462, 226-230 (2009).
- Punyashthiti, K., Finkelstein, R. A. Enteropathogenicity of Escherichia coli. I. Evaluation of mouse intestinal loops. Infect. Immun. 4, 473-478 (1971).
- Owen, R. L., Pierce, N. F., Apple, R. T., Cray, W. C. M cell transport of Vibrio cholerae from the intestinal lumen into Peyer’s patches: a mechanism for antigen sampling and for microbial transepithelial migration. J. Infect. Dis. 153, 1108-1118 (1986).
- Owen, R. L. M cells–entryways of opportunity for enteropathogens. J. Exp. Med. 180, 7-9 (1994).
- Clark, M. A., Hirst, B. H., Jepson, M. A. M-cell surface beta1 integrin expression and invasin-mediated targeting of Yersinia pseudotuberculosis to mouse Peyer’s patch M cells. Infect. Immun. 66, 1237-1243 (1998).
- Jensen, V. B., Harty, J. T., Jones, B. D. Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer’s patches. Infect. Immun. 66, 3758-3766 (1998).
- Nagai, S. Role of Peyer’s patches in the induction of Helicobacter pylori-induced gastritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8971-8976 (2007).
