Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M
Summary
الخلايا M في ظهارة جريب المرتبطة المتخصصة التي تغطي بقع باير لتلعب دورا هاما لالترصد المناعي المخاطي في الأمعاء المرتبطة الأنسجة اللمفاوية. نحن هنا وصف طريقة لتقييم من قبل خلايا جرثومية transcytosis M<em> في الجسم الحي</em>. هذا الأسلوب يوفر طريقة لفهم M – خلية وظيفة في الجهاز المناعي.
Abstract
ويسكن داخل القناة الهضمية لدينا مع عدد هائل من البكتيريا المتعايشة. ويتعرض بشكل مستمر على سطح الغشاء المخاطي في الجهاز الهضمي لهم وأحيانا لمسببات الأمراض. أنسجة الأمعاء المرتبطة اللمفاوية (GALT) تلعب دورا رئيسيا لتحريض الاستجابة المناعية المخاطية لهذه الميكروبات 1 و 2. لبدء الاستجابة المناعية المخاطية ، لا بد من نقل مستضدات المخاطية من لمعة الأمعاء عبر حاجز الظهارية في بصيلات اللمفاوية المنظمة مثل بقع باير. وتتوسط هذه transcytosis مستضد الخلايا المتخصصة التي الظهارية M 3 ، 4. الخلايا هي الخلايا الظهارية M شاذة أن يبلعم بنشاط الجزيئات والميكروبات. على عكس الخلايا الجذعية (DCS) ، والضامة ، لمولدات المضادات التي تستهدف lysosomes للتدهور ، الخلايا M transcytose أساسا المنضوية مستضدات. هذا transcytosis الجزيئات النشطة من خلال الخلايا M يسلم مستضد إلى بصيلات الكامنة اللمفاوية بتنظيمويعتقد د ضروريا لبدء المستضد محددة الاستجابات المناعية المخاطية. ومع ذلك ، فإن تعزيز هذه الآليات الجزيئية امتصاص المستضدات من قبل الخلايا M غير معروفة الى حد كبير. وأفادت ونحن في وقت سابق ان بروتين سكري 2 (GP2) ، وأعرب تحديدا على غشاء البلازما قمية من الخلايا M بين الخلايا المعوية ، بمثابة مستقبلات transcytotic لمجموعة فرعية من المتعايشة enterobacteria والممرضة ، بما في ذلك كولاي والسالمونيلا التيفية الفأرية enterica ضرب مصلي (س. التيفية الفأرية ) ، من خلال الاعتراف FimH ، وهو مكون من النوع الأول الشعرة على الغشاء الخارجي الجرثومي 5. هنا ، نقدم طريقة لتطبيق الفحص a باير الماوس ، حلقة التصحيح لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M. هذا الأسلوب هو نسخة محسنة من الحلقة مقايسة الماوس المعوية الموصوفة سابقا 6 ، 7. تحسين نقاط هي كما يلي : 1. وقد استخدم Isoflurane كوكيل مخدر. 2. حوالي 1 سم ligated امب حلقة المعويةتم تعيين جي التصحيح باير لتصل. 3. وكانت البكتيريا fluorescently المسمى تناولها من قبل الخلايا M بواسطة كاشف العلامات مضان أو overexpressing بروتين فلوري مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP). 4. تم الكشف عن الخلايا M في ظهارة جريب المرتبطة تغطي رقعة من قبل باير كله يشن immunostainig مع الأضداد المضادة GP2. 5. وقد لوحظت الفلورسنت transcytosis البكتيرية بواسطة خلايا M عن طريق التحليل المجهري متحد البؤر. ويمكن للمقايسة باير الماوس ، التصحيح حلقة المعوية توريد أي نوع من الإجابة المتعايشة أو البكتيريا المسببة للأمراض transcytosed بواسطة خلايا M ، ويمكن أن يقودنا إلى فهم الآلية الجزيئية لكيفية تنشيط جهاز المناعة من خلال الخلايا المخاطية M.
Protocol
Discussion
فترة حضانة من التصحيح باير ligated مع تعليق الجرثومي هو عادة لمدة 1 ساعة لمراقبة إدراج الجرثومي في الخلايا M. في حالة الحضانة 4 ساعات ، غالبا ما يتم الكشف عن البكتيريا في منطقة الخلايا التائية من بقع باير. كما يتبخر التخدير نشوق isoflurane الفئران يمكن أن تبقي مستقرة ، وفترة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر جميع أعضاء بنك الاستثمار الأوروبي لتطوير هذه التقنية. وأيد هذا البحث في جزء من المنح والمعونات وللبحوث العلمية في المجالات ذات الأولوية على "الاتجار الغشائية" (HO) ، و "ماتريكس من الظواهر المعدية" (KH) والعلماء الشباب (SF وKH) ، والبحث العلمي (HO ) ، والبحث العلمي في مجالات مبتكرة "الخدمات اللوجستية بين الخلايا" (HO) ، من وزارة التربية والتعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا في اليابان.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| LB Agar Ampicillin- 100 |
SIGMA | L5667 | |
| Cy3 mono-Reactive Dye Pack |
GE Healthcare | PA23001 | |
| Alexa Fluor 350 carboxylic acid, succinimidyl ester |
Invitrogen | A10168 | |
| Inhalation anesthesia apparatus |
Shinano Seisakusho | SN-487 | |
| Fixation and Permeabilization Solution |
BD | 554722 | |
| Anti mouse Glycoprotein 2 antibody |
MBL | D278-3 | 200-fold dilution (5μg/ml) |
| Goat Anti-Rat IgG, F(ab’)2 fragment specific |
Jackson ImmunoResearch |
112-505-006 | 200-fold dilution (20μg/ml) |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin |
Molecular Probes | A22284 | 50-fold dilution |
| Confocal laser scanning microscope |
Leica Microsystems | DMIRE2 | |
| DeltaVision Restoration deconvolution microscope |
Applied Precision | DeltaVision Core |
References
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).
- Hapfelmeier, S. Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Science. 328, 1705-1709 (2010).
- Owen, R. L., Jones, A. L. Epithelial cell specialization within human Peyer’s patches: an ultrastructural study of intestinal lymphoid follicles. Gastroenterology. 66, 189-203 (1974).
- Neutra, M. R., Mantis, N. J., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissues. Nat. Immunol. 2, 1004-1009 (2001).
- Hase, K. Uptake through glycoprotein 2 of FimH(+) bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462, 226-230 (2009).
- Punyashthiti, K., Finkelstein, R. A. Enteropathogenicity of Escherichia coli. I. Evaluation of mouse intestinal loops. Infect. Immun. 4, 473-478 (1971).
- Owen, R. L., Pierce, N. F., Apple, R. T., Cray, W. C. M cell transport of Vibrio cholerae from the intestinal lumen into Peyer’s patches: a mechanism for antigen sampling and for microbial transepithelial migration. J. Infect. Dis. 153, 1108-1118 (1986).
- Owen, R. L. M cells–entryways of opportunity for enteropathogens. J. Exp. Med. 180, 7-9 (1994).
- Clark, M. A., Hirst, B. H., Jepson, M. A. M-cell surface beta1 integrin expression and invasin-mediated targeting of Yersinia pseudotuberculosis to mouse Peyer’s patch M cells. Infect. Immun. 66, 1237-1243 (1998).
- Jensen, V. B., Harty, J. T., Jones, B. D. Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer’s patches. Infect. Immun. 66, 3758-3766 (1998).
- Nagai, S. Role of Peyer’s patches in the induction of Helicobacter pylori-induced gastritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8971-8976 (2007).
