Dissecando interação hospedeiro-vírus em replicação lítica de um herpesvírus modelo
Summary
Nós descrevemos um protocolo para identificar papéis fundamentais de moléculas de sinalização de acolhimento na replicação lítica de um herpesvírus modelo, gama herpesvírus 68 (γHV68). Utilizando linhagens de camundongos geneticamente modificados e fibroblastos embrionárias para γHV68 replicação lítica, o protocolo permite tanto caracterização fenotípica e molecular de interrogatório vírus-hospedeiro interações em replicação lítica viral.
Abstract
Em resposta a uma infecção viral, um hospedeiro desenvolve várias respostas de defesa, tais como a activação imune inata vias de sinalização que conduzem à produção de citocina 1,2 antiviral. A fim de colonizar o hospedeiro, os vírus são obrigatório para evadir respostas do hospedeiro anti-virais e manipular as vias de sinalização. Desvendando a interação hospedeiro-vírus vai lançar luz sobre o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas contra a infecção viral.
Murino γHV68 está intimamente relacionado com o herpesvírus humano oncogênico sarcoma de Kaposi associado e Epsten-Barr 3,4. γHV68 infecção em ratos de laboratório fornece um modelo animal tratável pequeno para examinar todo o curso da resposta do hospedeiro e infecção viral in vivo, que não estão disponíveis para o herpesvírus humanos. Neste protocolo, apresentamos um painel de métodos para caracterização fenotípica e dissecção molecular de componentes do hospedeiro sinalização em γHV68 replic líticoation in vivo e ex vivo. A disponibilidade das estirpes de rato geneticamente modificados permite a interrogação dos papéis das vias de sinalização do hospedeiro durante a infecção aguda γHV68 in vivo. Além disso, os fibroblastos de rato embrionários (MEFs) isoladas a partir destas estirpes de murganhos deficientes podem ser usados para dissecar ainda mais as funções destas moléculas durante γHV68 vivo lítica de replicação ex.
Usando ensaios de biologia molecular e virológicos, podemos identificar o mecanismo molecular de hospedeiro-vírus e identificar interacções hospedeiro e genes virais essenciais para a replicação virai lítica. Finalmente, um cromossoma artificial bacteriano sistema (BAC), facilita a introdução de mutações no factor de viral (s) que, especificamente, interromper a interacção hospedeiro-vírus. Recombinante γHV68 realização destas mutações podem ser usadas para recapitular os fenótipos de γHV68 replicação lítica em MEFs deficientes em hospedeiro chave sinalização componentes.Este protocolo oferece uma excelente estratégia para interrogar interação patógeno-hospedeiro em vários níveis de intervenção in vivo e ex vivo.
Recentemente, descobrimos que γHV68 usurpa uma via de sinalização imune inata a promover a replicação viral lítica 5. Especificamente, γHV68 de infecção ativa o novo IKKβ quinase imunológico e IKKβ ativada fosforila o mestre fator de transcrição viral, replicação e transativador (RTA), para promover a ativação da transcrição viral. Ao fazê-lo, de forma eficiente γHV68 casais sua ativação transcricional para sediar ativação imune inata, facilitando assim a transcrição e replicação lítico. Este estudo fornece um excelente exemplo que pode ser aplicado a outros vírus de interrogar hospedeiro-vírus interacção.
Protocol
Discussion
Em resposta a uma infecção viral, os MAV-dependentes imunes inatas vias de sinalização são activados para promover a produção de citocinas inflamatórias antivirais 10-14. Usando γHV68 murina como um modelo para o vírus herpes humano oncogênico sarcoma de Kaposi associado e vírus Epstein-Barr 3,4, descobrimos que γHV68 usurpa a via de MAV-IKKβ a promover a replicação viral via lítica de activação da transcrição 5. Empregando MEFs geneticamente modificado e técnicas d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. James (Zhijian) Chen (UT Southwestern, Biologia Molecular) para fornecimento de reagentes essenciais, incluindo os Mavs – / – ratos, e Ren Dr. Sun (Universidade da Califórnia-Los Angeles, Farmacologia e Medicina Molecular ) para proporcionar o cromossoma bacteriano artificial de γHV68 para este estudo.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 |
| Electro-MAX DH10B competent cells | Invitrogen | 18290-015 |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 |
| POWERPREP HP Plasmid Miniprep System | OriGene | NP100004 |
| POWERPREP HP Plasmid Midiprep System | OriGene | NP100006 |
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