Disección de Host-virus Interacción en la replicación lítica de un Herpesvirus Modelo
Summary
Se describe un protocolo para identificar las principales funciones de las moléculas de señalización de acogida en la replicación lítica de un modelo herpesvirus, virus herpes gamma 68 (γHV68). La utilización de cepas de ratón modificados genéticamente y los fibroblastos embrionarios de γHV68 replicación lítica, el protocolo permite tanto la caracterización fenotípica y molecular de las interacciones interrogatorio virus-huésped durante la replicación viral lítico.
Abstract
En respuesta a la infección viral, un huésped desarrolla varias respuestas de defensa, tales como la activación de las vías inmunológicas innatas de señalización que conducen a la producción de citoquinas 1,2 antiviral. Con el fin de colonizar el huésped, los virus son obligado a evadir las respuestas del huésped antivirales y manipular las vías de señalización. Desentrañar la interacción huésped-virus arrojará luz sobre el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas contra la infección viral.
Murine γHV68 está estrechamente relacionado con el sarcoma de Kaposi asociado a humano oncogénico del virus del herpes y Epsten-Barr 3,4. γHV68 infección en ratones de laboratorio proporciona un modelo de animal pequeño manejable para examinar todo el curso de las respuestas del huésped y la infección viral in vivo, que no están disponibles para los herpesvirus humanos. En este protocolo, se presenta un grupo de métodos para la caracterización fenotípica y molecular disección de componentes de sistema principal de señalización en γHV68 replic líticoación tanto in vivo como ex vivo. La disponibilidad de las cepas de ratón modificados genéticamente permite la interrogación de los papeles de las rutas de señalización de acogida durante γHV68 infección aguda in vivo. Además, fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) aisladas a partir de estas cepas de ratón deficientes se puede utilizar para diseccionar las funciones de estas moléculas durante γHV68 vivo ex lítico de replicación.
El uso de ensayos de biología molecular y virológicos, podemos señalar el mecanismo molecular de la interacción virus-huésped y anfitrión identificar y genes virales esenciales para la replicación viral lítica. Finalmente, un cromosoma artificial bacteriano (BAC) sistema facilita la introducción de mutaciones en el factor viral (s) que específicamente interrumpir la interacción huésped-virus. Recombinante γHV68 llevar estas mutaciones se puede utilizar para recapitular los fenotipos de γHV68 replicación lítica en MEFs deficientes en la clave de host componentes de señalización.Este protocolo ofrece una excelente estrategia para interrogar interacción huésped-patógeno en múltiples niveles de intervención in vivo y ex vivo.
Recientemente, se ha descubierto que γHV68 usurpa una vía de señalización inmune innata para promover la replicación viral lítico 5. Específicamente, γHV68 de novo infección activa la quinasa IKKβ inmune y IKKβ activada fosforila el factor de transcripción viral maestro, la replicación y transactivador (RTA), para promover la activación transcripcional viral. Al hacerlo, γHV68 eficientemente su pareja de activación transcripcional de acoger la activación inmune innata, facilitando de ese modo la transcripción y la replicación viral lítica. Este estudio proporciona un excelente ejemplo de que se puede aplicar a otros virus para interrogar a la interacción huésped-virus.
Protocol
Discussion
En respuesta a la infección viral, los MAVS dependientes de las vías inmunológicas innatas de señalización se activan para promover la producción de citoquinas inflamatorias antivirales 10-14. Uso de murino γHV68 como un virus modelo para asociado al sarcoma de Kaposi humano oncogénico del virus del herpes y virus de Epstein-Barr 3,4, descubrimos que γHV68 usurpa la vía MAVS-IKKβ para promover la replicación lítico viral a través de la activación transcripcional 5. Emplean…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. James (Zhijian) Chen (UT Southwestern, Biología Molecular) para proporcionar reactivos esenciales, incluidos los Mavs – / – ratones, y el Dr. Ren Sol (Universidad de California-Los Angeles, Farmacología y Medicina Molecular ) para proporcionar el cromosoma bacteriano artificial de γHV68 para este estudio.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 |
| Electro-MAX DH10B competent cells | Invitrogen | 18290-015 |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 |
| POWERPREP HP Plasmid Miniprep System | OriGene | NP100004 |
| POWERPREP HP Plasmid Midiprep System | OriGene | NP100006 |
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