Sezieren Host-Virus-Interaktion in Lytic Replikation von einem Modell Herpesvirus
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll zu den wichtigsten Aufgaben der Host Signalmoleküle in lytische Replikation eines Modells Herpesvirus, gamma Herpesvirus 68 (γHV68) zu identifizieren. Mit Hilfe genetisch veränderter Mauslinien und embryonale Fibroblasten zur γHV68 lytische Replikation, erlaubt das Protokoll sowohl phänotypische Charakterisierung und molekulare Vernehmung von Virus-Wirt-Interaktionen in lytischen Replikation.
Abstract
In Reaktion auf virale Infektion, entwickelt eine Vielzahl verschiedener Abwehrreaktionen, wie die Aktivierung angeborenen Immunsystems Signalwege, die die antivirale Zytokin-Produktion 1,2 führen. Um den Host besiedeln, sind Viren obligat zu Host Reaktionen antiviralen entziehen und zu manipulieren Signalwege. Die Aufklärung der Wirt-Virus-Interaktion wird Licht auf die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien gegen virale Infektionen zu vergießen.
Murine γHV68 ist eng mit menschlichen onkogenen Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus und Epsten-Barr-Virus 3,4 verwandt. γHV68 Infektion in Mäusen eine tractable kleinen Tiermodell, um den gesamten Verlauf der Host Reaktionen und viralen Infektion in vivo, die nicht verfügbar sind für den menschlichen Herpesviren untersuchen. In diesem Protokoll, präsentieren wir ein Panel von Methoden zur phänotypischen Charakterisierung und molekulare Zerlegung des Host-Signalisierungs-Komponenten in γHV68 lytische replication in vivo und ex vivo. Die Verfügbarkeit von genetisch veränderten Mausstämmen erlaubt die Abfrage der Rollen von Host Signalwege während γHV68 akute Infektion in vivo. Darüber hinaus können embryonale Maus-Fibroblasten (MEF) aus diesen defizienten Mäusen isolierten Stämme zur weiteren sezieren Rolle dieser Moleküle während γHV68 lytische Replikation ex vivo werden.
Mit virologische und molekularbiologische Tests, können wir ermitteln den molekularen Mechanismus der Wirt-Virus-Interaktionen und identifizieren Host und viralen Gene essentiell für lytischen Replikation. Schließlich erleichtert ein bakterielles künstliches Chromosom (BAC)-System die Einführung von Mutationen in den viralen Faktor (en), die spezifisch unterbrechen die Wirt-Virus-Interaktion. Rekombinante γHV68 Durchführung dieser Mutationen können die Phänotypen der γHV68 lytische Replikation in MEFs Mangel an wichtigen Host Signalkomponenten rekapitulieren werden.Dieses Protokoll bietet eine exzellente Strategie, um Wirt-Pathogen-Interaktion auf mehreren Ebenen der Intervention in vivo und ex vivo zu verhören.
Kürzlich haben wir entdeckt, dass γHV68 usurpiert eine angeborene Immunsystem Signalweg zur lytischen Replikation 5 zu fördern. Insbesondere aktiviert γHV68 de novo Infektion das Immunsystem Kinase IKK und aktiviert IKK phosphoryliert den Master viralen Transkriptionsfaktor, Replikation und Transaktivator (RTA), um virale Transkriptionsaktivierung zu fördern. Dabei γHV68 effizient Paare ihre Transkriptionsaktivierung zu angeborenen Immunaktivierung hosten, wodurch Transkription und viralen lytische Replikationsursprung. Diese Studie liefert ein hervorragendes Beispiel, die andere Viren angewendet werden kann, um Wirt-Virus-Interaktion zu verhören.
Protocol
Discussion
In Reaktion auf virale Infektion werden die MAVS-abhängigen Signalwege angeborene Immunsystem aktiviert, um die Herstellung von antiviralen inflammatorischen Zytokinen 10-14 fördern. Mit murine γHV68 als Modell Virus für Menschen onkogenen Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus und Epstein-Barr-Virus 3,4 entdeckten wir, dass γHV68 usurpiert die Mavs-IKK Weg zur lytischen Replikation über Transkriptionsaktivierung 5 zu fördern. Verwendung genetisch veränderter MEFs und Techniken i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Dr. James (Zhijian) danke Chen (UT Southwestern, Molecular Biology) für die Bereitstellung von wesentlichen Reagenzien, einschließlich der Mavs – / – Mäuse und Dr. Ren Sun (University of California-Los Angeles, Pharmakologie und Molekulare Medizin ) zur Bereitstellung des bakteriellen künstlichen Chromosom γHV68 für diese Studie.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 |
| Electro-MAX DH10B competent cells | Invitrogen | 18290-015 |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 |
| POWERPREP HP Plasmid Miniprep System | OriGene | NP100004 |
| POWERPREP HP Plasmid Midiprep System | OriGene | NP100006 |
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