Una PCR para la identificación de Allelotyping Salmonella enterica Serotipos Enteritidis, Hadar, Heidelberg, y Typhimurium

1. Preparación de la plantilla de PCR Nota: A fin de minimizar la contaminación remanente PCR, es importante tener varios pasos importantes clave en la PCR físicamente separados entre sí: 1) plantilla (ADN) preparación, 2) configuración de PCR, y 3) electroforesis en gel. También se recomienda el uso de puntas de barrera para evitar la contaminación de la cultura o el reactivo de pipetas. Inocular 1 ml de caldo Luria Bertani u otro medio de complejos (infusión cerebro corazón, Superbroth, etc) con Salmonella aislado de una colonia aislada. Incubar cultivo de una noche a 37 ° C. Transferir 1 ml de una solución estéril, 1,5 ml tubo de microcentrífuga de capacidad, se centrifuga la suspensión celular de las bacterias a 4.500 xg durante 2 minutos en. para precipitar las células. Decantar el sobrenadante, resuspender el botón celular en 1 ml de etanol al 100% y establecer a temperatura ambiente durante 10 min. Precipitar las células como antes (4.500 xg, 2 min.), Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de PBS. Centrifugar las células (4.500 xg, 2 min.), Descartar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de agua estéril dH 2 O. Diluir la suspensión celular final 1 / 20 en dH 2 O (5 μl/95 l dH 2 O) y almacenar a -20 ° C. La vida útil de las células de todo como plantilla de PCR a -20 ° C es aproximadamente un mes. 2. PCR de configuración Nota: La preparación y dispensación de la mezcla de reacción PCR (plantilla, tampones, oligonucletoideprimers, nucleótidos y Taq polimerasa) se debe realizar en una habitación separada físicamente y dedicada preferentemente en una estación de trabajo PCR / UV. Nota: La PCR establecer habitación también debe ser auto-contenida con un designado congelador a -20 ° C para el almacenamiento de los reactivos de PCR (buffers, oligonucleótidos, y los nucleótidos), las enzimas y la plantilla, pipeteador dedicada conjunto para la configuración de PCR, guantes de látex desechables , bata de laboratorio, consejos barrera, placas de microtitulación, capilares de vidrio, tubos de microcentrífuga y lejía al 10% para descontaminar las superficies. Utilizar un conjunto dedicado pipeteador (P10, P100, P1000 y) para dispensar los reactivos PCR. Este conjunto de pipeta no debe salir de la estación de trabajo de puesta a punto. Nota: Obtención de la biología molecular o PCR grado dH 2 O y la alícuota de 1 ml en tubos de 1,5 ml de capacidad centrífuga. Dispensar alícuotas dH 2 O después de cada uso para evitar una posible contaminación cruzada. Un enfoque similar se recomienda con los otros reactivos PCR. Nota: Descontaminar el área de trabajo antes de su uso con iluminación UV y / o limpiar superficies con lejía al 10%. Utilizar una bata de laboratorio y guantes de látex en la realización de configuración de PCR. Minimizar el tráfico de ida y vuelta de PCR puesta a punto para las zonas donde la reacción de PCR se incuban en la thermocylcer y productos de la PCR (amplicones) son separados en geles de agarosa. Si nos remontamos en la PCR set-up área, deshacerse de los pares de guantes de látex que se está usando y se puso un nuevo par de guantes. Hacer una acción manual maestro en dH 2 O a una concentración de 5×10 -4 M. Diluir los cebadores 1 / 20 en dH 2 O (5 μl/95 l dH 2 O, 25 M). La secuencia de oligonucleótidos para cada primer escribiendo flagelina se describe en la Tabla 1. Recuperar los reactivos PCR y la plantilla del congelador a -20 ° C, y permitir que los reactivos y muestras para descongelar el hielo. Salir de la Taq ADN polimerasa en el congelador hasta que se necesite. Prescindir de los reactivos para la mezcla de reacción de PCR allelotyping como se describe en la Tabla 1. Prescindir 9μl de la mezcla de reacción de PCR en cada una de 10 pozos de fondo redondo en un recipiente estéril, de 96 pozos, placa de microtitulación de poliestireno, comenzando en la parte superior de la columna (por ejemplo, A1) y se extiende hacia la columna de la parte superior de la siguiente. Añadir 1 l de dH 2 O a la l 9 de PCR mezcla (sin control de ADN) para el primer pozo (A1), 0.5μl de las plantillas de control positivo (i / g, m escribiendo primers-Typhimurium y Enteritidis; r/z10 escribiendo primers-Heidelberg y Hadar, y 1,2 / e, n, x escribiendo primers-Typhimurium y Hadar) a 9 l de la mezcla de PCR en el 2 º y (B1), y 1 l de Escherichia coli K12 DH5a a la 9 ml de la mezcla de PCR en el tercer pozo (C1). Para cada pozo adicional (D1-H1, A2, B2), añadir 1 l de la plantilla de muestra descongelada a la l 9 de la mezcla de reacción de PCR. Para el S. i / g, m allelotyping PCR, enterica serovar Typhimurium (i) y Enteritidis (g, m) se utilizan como controles positivos, y Salmonella serovares Heidelberg (r) y Hadar (z10) son los controles positivos para el r / z 10 allelotyping multiplex PCR. Lugar 10 l de capacidad capilares de vidrio en los titulares designados por el Rapidcycler Idaho Tecnología (8). una vez conseguido en el soporte, la carga de cada vaso capilar con la mezcla de reacción de PCR al tocar el capilar a lapocillos de fondo de la placa de microtitulación. Incline el soporte para permitir que el líquido se mueve por el tubo y ofrecer un espacio entre los extremos y la mezcla de PCR antes de sellado térmico de los tubos de vidrio con un soplete de butano para sellar ambos extremos de los capilares. Coloque los tubos capilares y soporte en el Rapidcycler Idaho Tecnología y el uso de programas termociclador describen en la Tabla 1 para los primers allelotyping diferentes para ejecutar el PCR. Continúe con el paso de electroforesis en gel cuando el programa del termociclador se haya completado. 3. Electroforesis en gel Nota: Utilizar una bata de laboratorio diferentes designado para su uso en el laboratorio de electroforesis y un nuevo par de guantes de látex desechables. Nota: Usar gafas de protección UV o protector facial y siempre guantes cuando se manipule bromuro de etidio, especialmente en geles de agarosa. Preparar 100 ml fundido 1,5% (w / v) de la biología molecular grado de agarosa en 1xTAE (o 1X TBE) tampón de electroforesis (7) en varias ocasiones el calentamiento de la suspensión de agarosa en un microondas fija en el 20% de potencia durante 2-5 minutos, con intervalos periódicos visual inspección. Establecer la agarosa fundida en el baño de agua 60 ° C hasta que se equilibra con la temperatura del baño de agua. Configurar el molde de gel con peine antes de verter la agarosa fundida. Elija un peine con dientes gel suficiente para producir los pozos suficientes para los controles, las muestras, y al menos tres estándares de peso molecular para su colocación en los extremos y el centro de la gel de agarosa. Añadir 2 l de bromuro de etidio (10 mg / ml) a 100 ml de líquido de 1,5% (w / v) de agarosa en 1xTAE (TBE), con cuidado la botella agitar para mezclar, evitar la producción de burbujas, y con cuidado vierta el contenido de la botella en el centro del molde de gel de 15 por 10 cm de gel de agarosa. Utilice el borde de un pañuelo de papel o una toalla de papel para eliminar las burbujas en el gel de agarosa. Deje que el molde de gel de establecer a temperatura ambiente hasta que se solidifica de agarosa (~ 30-45 min). La transferencia de la bandeja de gel con gel y peine para sumergibles, cámara de electroforesis horizontal que contiene 1X TAE (o 1X TBE) tampón de electroforesis. Retire con cuidado el peine del gel de agarosa. Compruebe la colocación de la bandeja de gel en relación con el cátodo o polo positivo de la cámara de electroforesis para asegurarse de que este polo está en la parte inferior del gel. Nota: Recuerde que el ADN cargado negativamente migra hacia el cátodo (es decir, "correr al rojo"). Premezcla de 200 l de marcadores de ADN de peso molecular (0,25 mg / l) con 40 l de colorante de carga 6X ADN. Carga 4,8 l de la premezcla peso molecular del ADN marcador XIV de los primeros pozos, segundo nombre y apellido. De carga cada una de las muestras de PCR a partir de 2 y así avanzar a cada pocillo posterior, de izquierda a derecha. Evitar la colocación de la muestra en cualquiera de los pozos que contienen los estándares de peso molecular. Para cargar las muestras contenidas en cada vaso capilar: Retire cada capilar de su soporte y grabar ambos lados del capilar con un cortador de vidrio. Coloque el pulgar y el dedo índice de ambas manos a ambos lados del capilar marcada por el cortador de vidrio y coloque el tubo capilar. Coloque el dispensador capilar en el extremo opuesto de la mezcla de reacción PCR y gire lentamente el émbolo de las agujas del reloj hasta que el líquido se encuentra en la parte inferior del tubo. Colocar los capilares en el pozo para ser cargados y gire lentamente el émbolo hacia la derecha para dispensar la muestra Ficoll-ponderada en la agarosa bien. Tenga cuidado de no perforar el pozo con el capilar o introducir una burbuja de aire en el pozo girando demasiado pasado, cuando el último de el líquido sale del capilar. Una vez que todas las muestras y estándares se cargan, ajustar la tensión constante de la fuente de alimentación de 90 V (9 volts / cm en gel de agarosa). Deje de electroforesis una vez que el colorante amarillo (Taurazine) frente es de 1 cm de la parte inferior del gel. Una vez se haya completado la electroforesis, el gel para la transferencia de un transiluminador UV para visualizar fragmentos de ADN y el estándar de peso molecular. Captura de imágenes en la película Polaroid usando una cámara Polaroid con naranja filtro de vidrio (configuración: 2 x, y y 4.5) o como una imagen digital con una cámara CCD y la imagen de impresión con una impresora térmica. Coloque los titulares de capilares en 10% de lejía durante 15-30 min. Enjuague tres veces con dH 2 O y vuelva a colocar en la habitación de la configuración de PCR se seque al aire. 4. Representante Multiplex PCR Resultados Resultados para allelotyping PCR de aislamientos de Salmonella 10.01 se muestra en la Figura 1 (carriles 3-12) e interpretado de la siguiente manera. Una designación alelo S se da a aislar Salmonella basado en amplificación (producto de PCR) que coincida en tamaño con el control de PCR y como se había predicho para el primer alelo S conjuntos utilizados (3): B-560bp, 340bp-C1, C2-400 pb, D1-620 pb, pb y E1-280. De las cepas aisladas de la PCR O allelotyping (Fig. 1A), se ha asignado S alelos B (líneas 10 -13), C1 (carriles 7-9), C2 (calles 4, 5), D1 (calle 3) y E1 (calle 6) a las diez cepas aisladas de Salmonella en los carriles de 3.12. Estas cepas de Salmonella mismo se pusieron a prueba, en el mismo orden que en la figura. 1A, los alelos i H1; g, m, r, y z10 (Fig. 1B, C). Una vez más, un alelo H1 se asigna a cada aislamiento depende de la presencia de un amplicón de tamaño correspondiente al control de PCR y como se había predicho para el primer H1 alelo 4 juegos utilizados (3): i-510 pb (Fig. 1B, carril 2 ), g, m-310 pb (Fig. 1B, carril 2), R-170 pb (Fig. 1C, carril 2), y Z10-360 pb (Fig. 1C, carril 2). Alelos H1 fueron asignados a uno de los diez aislamientos de Salmonella: i – aislados de 3 y 8 (Fig. 1B, carriles 5 y 10), g, m-cepas 1 y 5 (fig. 1B, carriles 3 y 7), r aislados de 6 y 9 (Fig. 1C, calles 8 y 11);. z10 y aísla a 2, 7, y 10 (Fig. 1C, carriles 4, 9 y 12) Salmonella aislar 4 fue negativo para los cuatro alelos H1 prueba. Finalmente, los aislamientos de Salmonella fueron analizadas por PCR de los alelos asociados con el H2 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 y complejo antígeno e, n, x, e, n, Z15 complejo antígeno. Los cebadores para el H2 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 y complejo H2 e, n, x, e, n, Z15 complejo de producción de 290 pb y 150 pb amplicones, respectivamente (3). El primer sets no puede distinguir alelos específicos en cualquiera de antígeno H2 H2 complejo para asignar un tipo de alelo definitiva, ej. 1,2, a un aislamiento (3) los aislamientos de Salmonella 4, 6, 8-10 fueron positivos para los alelos asociados con H2 H2 1,2;. 1,5; 1,6; 1,7 complejo antígeno, mientras que los aislados 2 y 7 fueron positivas para los alelos asociados con H2 e, n, x, e, n, Z15 complejo antígeno (datos no mostrados). Mientras que los aislamientos de Salmonella 1, 3, y 5 fueron negativos para los dos complejos antígeno-H2, sólo cepas 1 y 5 fueron negativos para la flagelina H2, como se determina utilizando un genérico H2 flagelina PCR (1) (datos no muestran). Estos resultados se resumen en la Tabla 2, junto con el serovar de Salmonella presunto asignado a cada aislamiento. Figura 1. PCR múltiple para la identificación específica de O y H alelos asociados con S. enterica serovares Enteritidis, Hadar, Heidelberg, y Typhimurium. (A) O alelos Multiplex PCR. (B, C) H1 Alelo Multiplex PCR para la identificación de alelos flagelina: i / g, m (B) y r/z10 (C). Carriles 1 y 13: escalera de 100 pb (Promega, Madison, WI), carril 2: multiplex PCR controles para los alelos S B, C1, C2, D1 y E (A), H1 alelos i / g, m (B), y alelos H1 r/z10 (C), y carriles de 3.12: los aislamientos de Salmonella 1-10 (Tabla 2). PCR Master Mix Termociclador (Rapidcycler) Reactivos Composición / concentración Cantidad   Parámetros Tamaño de espera H1 i / g, m dH 2 O 63 l Programa 1 94 ° C durante 1 minuto 10X PCR buffer 20 mM MgCl 2 10 l Programa 2 94 ° C durante 1 s 500 mMTris pH8 55 ° C durante 1 s 2,5 mg / ml de BSA 72 ° C durante 20 s 5% de Ficoll 400 Durante 40 ciclos 10 mMTartrazine Pendiente = 2,0 Primer i (f) * AACGAAATCAACAACAACCTGC 2 l Programa 3 72 ° C durante 4 minutos 510 pb Primer i (r) * TAGCCATCTTTACCAGTTCCC 2 l Primer g, m (f) * GCAGCAGCACCGGATAAAG 2 l 310 pb Primer g, m (r) * CATTAACATCCGTCGCGCTAG 2 l DMSO 5 l dNTP 10 mM 2 l Taq 5 unidades / l 2 l 90 l H1 r / z 10 dH 2 O 55 l Programa 1 94 ° C durante 1 minuto 10X PCR buffer 30 mM MgCl 2 10 l Programa 2 94 ° C durante 1 s 500 mMTris pH8 55 ° C durante 1 s 2,5 mg / ml de BSA 72 ° C durante 20 s 5% de Ficoll 400 Durante 40 ciclos 10 mMTartrazine Pendiente = 2,0 Primer r (f) * CCTGCTATTACTGGTGATC 4μl Programa 3 72 ° C durante 4 minutos 170 pb Primer r (r) * GTTGAAGGGAAGCCAGCAG 4μl Primer z 10 (f) * GCACTGGCGTTACTCAATCTC 4μl 360 pb Primer z 10 (r) * GCATCAGCAATACCACTCGC 4μl DMSO 5 l dNTP 10 mM 2 l Taq 5 unidades / l 2 l 90 l PCR Master Mix Termociclador (Rapidcycler) Reactivos Composición / concentración Cantidad   Parámetros Tamaño de espera H2 1,2 / e, n, x dH 2 O 63,6 l Programa 1 94 ° C durante 1 minuto 10X PCR buffer 20 mM MgCl 2 10 l Programa 2 94 ° C durante 1 s 500 mMTris pH8 55 ° C durante 1 s 2,5 mg / ml de BSA 72 ° C durante 20 s 5% de Ficoll 400 Durante 40 ciclos 10 mMTartrazine Pendiente = 2,0 Primer 1,2 (f) * AGAAAGCGTATGATGTGAAA 2 l Programa 3 72 ° C durante 4 minutos 290 pb Primer 1,2 (r) * ATTGTGGTTTTAGTTGCGCC 2 l Primer e, n, x (f) * TAACTGGCGATACATTGACTG 2 l 150 pb Primer e, n, x (r) 1 TAGCACCGAATGATACAGCC 2 l DMSO 5 l dNTP 10 mM 2 l Taq 5 unidades / l 2 l 90 l Genérico H2 dH 2 O 72 l Programa 1 94 ° C durante 1 minuto 10X PCR buffer 30 mM MgCl 2 10 l Programa 2 94 ° C durante 10 s 500 mMTris pH8 45 ° C durante 10 s 2,5 mg / ml de BSA 72 ° C durante 35 s 5% de Ficoll 400 Durante 40 ciclos 10 mMTartrazine Pendiente = 2,0 Primer fljB (f) * CAAGTAATCAACACTAACAGTC 2 l Programa 3 72 ° C durante 4 minutos 1.500 pb Primer fljB (r) * TTAACGTAACAGAGACAGCAC 2 l dNTP 10 mM 2 l Taq 5 unidades / l 2 l 90 l Tabla 1. Protocolo para la Salmonella flagellinallelotyping PCR: composición, condiciones y resultados esperados. * La concentración de valores de trabajo de los oligonucleótidos de PCR es de 25 M Aislar O alelos H1 alelos H2 alelos Serovar   B C1 C2 D1 E yo g, m r z10 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 e, n, x, e, n, Z15 Genérico 1   1 – – – + – – + – – – – – Enteritidis 2 – – + – – – – – + – + + Hadar / Estambul 3 3 – – + – – + – – – – – + Kentucky 4 – – – – + – – – – + – + Desconocido 5 – + – – – – + – – – – – Montevideo 6 – + – – – – – + – + – + Infantis o Virchow 2 7 – + – – – – – – + – + + Mbandaka 8 + – – – – + – – – + – + Typhimurium 9 + – – – – – – + – + – </td> + Heidelberg 10 + – – – – – – – + + – + Haifa Tabla 2. Allelotyping resultados de la PCR (Fig. 1) y designación de Salmonella serovar basado en la identificación de la O, H1, H2 y los alelos > 1 H2 PCR produce una amplificación de 1,5 kb para todos los serotipos poseen flagelina H2, H2, independientemente de los alelos (1). Esta PCR se utiliza para distinguir monofásica de la Salmonella bifásica. 2 H2 multiplex PCR no puede distinguir entre los diferentes alelos para el H2 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 complejo antígeno (3). 3 Fago conversión de S. enterica serovar Hadar altera LPS O antígeno para producir serovar Estambul. El O allelotyping PCR no puede discernir estos sutiles cambios genéticos / antigénica. Serotipo 1 O alelos H1 alelos H2 alelos   B C1 C2 D1 E yo g, m r z10 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 e, n, x, e, n, Z15 Genéricas 2 California + – – – – – + – – – – – Typhimurium + – – – – + – – – + – + Heidelberg + – – – – – – + – + – + Haifa + – – – – – – – + + – + Montevideo – + – – – – + – – + – + Othmarschen – + – – – – + – – – – – Athinai – + – – – + – – – – + + Papuana – + – – – – – + – – + + Mbandaka – + – – – – – – + – + + Chincol – – + – – – + – – – + + Kentucky – – + – – + – – – – – + Hadar / Estambul 3 – – + – – – – – + – + + Enteritidis – – – + – – + – – – – – La Serena – – – + – + – – – + – + Campinense – – – + – – – + – – + + Lomé – – – + – – – + – – – + Portland – – – + – – – – + + – + Ruanda – – – + – – – – + – + + Treguier – – – + – – – – + – – + Simi – – – – + – – + – – + + Weltevreden – – – – + – – + – – – + Kristianstad – – – – + – – – + – + + Biafra – – – – + – – – + – – + Tabla 3. Salmonella enterica serovares identificados por PCR Allelotyping Los serotipos 1 resaltados en negrita son los más comúnmente encontrados por diagnóstico o laboratorio de microbiología de los alimentos. 2 H2 PCR produce una amplificación de 1,5 kb para todos los serotipos poseen flagelina H2, H2, independientemente de los alelos (1). Esta PCR se utiliza para distinguir monofásica de la Salmonella bifásica. 3 Fago conversión de S. enterica serovar Hadar altera LPS O antígeno para producir serovar Estambul. El O allelotyping PCR no puede discernir estos sutiles cambios genéticos / antigénica.