Uma PCR Allelotyping para Identificar Salmonella enterica Sorovares Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium

1. Preparação de modelos PCR Nota: A fim de minimizar PCR contaminações, é importante manter vários passos importantes na PCR fisicamente separados um do outro: 1) a preparação de modelo (DNA), 2) PCR setup, e 3) eletroforese em gel. Também é recomendado o uso de dicas de barreira para evitar que a cultura ou a contaminação do reagente pipetters. Inocular 1 ml de caldo de Luria Bertani ou meio complexo demais (Infusão de cérebro, coração Superbroth, etc) com Salmonella isolado de uma única colônia isolada. Incubar a cultura durante a noite a 37 ° C. Transferir 1 ml para um estéril de 1,5 ml, tubo de microcentrífuga, capacidade de centrifugação da suspensão de células bacterianas a 4.500 xg por ~ 2 min. para as células da pelota. Decantar o sobrenadante, ressuspender o pellet celular em 1 ml de etanol 100% e fixada em temperatura ambiente por 10 min. Células pelota como antes (4.500 xg, 2 min.), Remover as células sobrenadante e ressuspender em 1 ml de PBS. Células de centrifugação (4500 xg, 2 min.), Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de estéril dH 2 O. Diluir a suspensão celular final 1 / 20 em dH 2 O (5 mL μl/95 dH 2 O) e armazenar a -20 ° C. O prazo de validade das células inteiro como modelo de PCR a -20 ° C é de cerca de um mês. 2. PCR Setup Nota: A preparação e distribuição da mistura de reacção da PCR (modelo, buffers, oligonucletoideprimers, nucleotídeos e Taq DNA polimerase) precisa ser realizada em uma sala separada fisicamente dedicada e, de preferência feito em uma estação de trabalho PCR / UV. Nota: A PCR configurar sala também deve ser auto-suficiente com um freezer -20 ° C designado para o armazenamento de reagentes PCR (buffers, primers, e nucleotídeos), enzimas e modelo, pipeta dedicada definido para PCR setup, luvas descartáveis ​​de látex , laboratório casaco, dicas de barreira, placas de microtitulação, capilares de vidro, tubos e lixívia a 10% para superfícies de descontaminação. Use um conjunto pipeta dedicado (P10, P100 e P1000) para dispensar reagentes PCR. Este conjunto de pipeta nunca deve deixar a estação de trabalho de configuração. Nota: Obter biologia molecular ou PCR grau dH 2 O e alíquota de 1 ml em 1,5 ml tubos de centrífuga de capacidade. Dispense alíquotas dH 2 O após cada utilização para evitar possível contaminação cruzada. Uma abordagem semelhante é recomendado com o outros reagentes PCR. Nota: Descontaminar a área de trabalho antes do uso com iluminação UV e / ou limpar as superfícies com água sanitária a 10%. Usar bata de laboratório e luvas de látex na realização de instalação PCR. Minimizar frente e para trás o tráfego de PCR set-up para áreas onde as reações de PCR são incubados na thermocylcer e produtos de PCR (amplicons) são separados em gel de agarose. Se você voltar para a área de PCR set-up, descarte o par de luvas de látex que você está usando e colocar um novo par de luvas. Faça um estoque primário mestre em dH 2 o a uma concentração de 5×10 -4 M. Diluir o primers 20/01 em dH 2 O (5 mL μl/95 dH 2 o, 25 mM). A seqüência de oligonucleotídeos para cada primer digitando flagelina é descrito na Tabela 1. Recuperar reagentes PCR e modelo de -20 ° C freezer, e permitir que os reagentes e amostras para descongelar em gelo. Deixe a Taq DNA polimerase em freezer até ser necessário. Dispensar reagentes para allelotyping mistura da PCR, conforme descrito na Tabela 1. Dispense 9μl da mistura da PCR em cada um dos 10 poços de fundo redondo em uma placa de microtitulação estéreis, de 96 poços, poliestireno, começando no topo da coluna (por exemplo, A1) e descendo a coluna para o topo da próxima. Adicionar 1 ml de dH 2 O à mL 9 de PCR mix (sem controle de DNA) para o primeiro poço (A1), 0.5μl dos modelos de controle positivo (i / g, m digitando primers-Typhimurium e Enteritidis; r/z10 digitando primers-Heidelberg e Hadar, e 1,2 / e, n, x digitando primers-Typhimurium e Hadar) a 9 mL da mistura da PCR em 2 º bem (B1), e 1 ml de Escherichia coli K12 DH5α ao 9 ml da mistura de PCR no terceiro poço (C1). Para cada poço adicional (D1-H1; A2, B2), adicionar 1 ml de amostra do modelo descongelado à mL 9 da mistura de reacção da PCR. Para o S. i / g, m allelotyping PCR, enterica serovar Typhimurium (i) e Enteritidis (g, m) servem como controles positivos e Salmonella sorovares Heidelberg (r) e Hadar (z10) são os controles positivos para a r / z 10 allelotyping multiplex PCR. Coloque 10 ml de capacidade em capilares de vidro titulares designados para a Tecnologia de Idaho Rapidcycler (8). uma vez garantido no suporte, a carga de cada capilar de vidro com a mistura da PCR, tocando o capilar aopoços de fundo da placa de microtitulação. Incline o titular deixe o líquido mover para baixo o tubo e fornecer o espaço entre as extremidades ea mistura PCR antes calor de vedação dos tubos de vidro com uma tocha butano para selar ambas as extremidades dos capilares. Coloque os tubos capilares e suporte na tecnologia Idaho Rapidcycler e usar programas termociclador descrito na Tabela 1 para os primers allelotyping diferentes para executar o PCR. Vá para a etapa de eletroforese em gel quando o programa estiver concluído termociclador. 3. Eletroforese em gel Nota: Usar um jaleco diferentes designado para uso em laboratório de eletroforese e um novo par de luvas de látex descartáveis. Nota: Usar óculos de proteção UV olho de proteção ou viseira e sempre foram luvas ao manusear brometo de etídio, gel especialmente agarose. Prepare 100 ml de fundição de 1,5% (w / v) de biologia molecular na grade agarose 1xTAE (ou 1X TBE) tampão de eletroforese (7) por várias vezes o aquecimento da suspensão agarose no microondas fixado em poder de 20% para 2-5 min com intervalos visuais periódicas inspeção. Definir a agarose fundida em banho-maria 60 ° C até que equilibra a temperatura do banho-maria. Configurar o molde gel com pente antes de derramar a agarose fundida. Escolha um pente com dentes de gel suficiente para produzir o suficiente para poços controles, amostras e, pelo menos, três padrões de peso molecular de suas colocações nas extremidades e no meio do gel de agarose. Adicione 2 mL de brometo de etídio (10 mg / ml) para 100 ml de fundição de 1,5% (w / v) de agarose em 1xTAE (ou TBE), gentilmente garrafa agite para misturar, evitar a produção de bolhas, e gentilmente despeje o conteúdo do frasco para o meio do molde gel por 15 por 10 cm de agarose gel. Use a borda do papel de tecido ou papel toalha para remover quaisquer bolhas no gel de agarose. Deixe o molde gel fixado em temperatura ambiente até agarose solidifica (~ 30-45 min). Transferir o tabuleiro de gel com gel e pente para submersíveis, câmara de eletroforese horizontal contendo 1X TAE (ou 1X TBE) tampão de eletroforese. Remova cuidadosamente o pente do gel de agarose. Verificar o posicionamento da bandeja de gel em relação ao catodo ou pólo positivo da câmara de eletroforese para ter certeza este pólo é na parte inferior do gel. Nota: Lembre-se do DNA carregados negativamente migra para o cátodo (ou seja, "correr para o vermelho"). Premix 200 mL de marcadores de peso molecular do DNA (0,25 mcg / mL) com 40 mL de tintura 6X DNA Carregando. Load 4,8 mL do pré-misturado DNA Peso Molecular marcador XIV à primeira, poços e meio passado. Carga cada uma das amostras PCR começando com dois bem e avançando a cada poço subseqüente, se movendo da esquerda para a direita. Evitar o carregamento da amostra em qualquer um dos poços contendo o padrão de peso molecular. Para carregar amostras contidas em cada capilar de vidro: Retire cada capilar a partir de seu titular e etch ambas as extremidades do capilar com um cortador de vidro. Coloque o polegar eo indicador das duas mãos em cada lado do capilar marcado pelo cortador de vidro e encaixe do capilar. Coloque o dispenser capilar na extremidade oposta da mistura de reacção da PCR e vire lentamente o êmbolo no sentido horário até que o líquido está na parte inferior do tubo. Coloque o capilar dentro do poço a ser carregado e vire lentamente o êmbolo no sentido horário para dispensar a amostra Ficoll-ponderada para a agarose bem. Tenha cuidado para não perfurar o poço com o capilar ou introduzir uma bolha de ar no poço girando muito passado, quando o último do líquido sai do capilar. Uma vez que todas as amostras e os padrões são carregados, definir a tensão constante da fonte de alimentação de 90 V (9 volts / cm agarose gel). Descontinuar a eletroforese quando o corante amarelo frente (Taurazine) é de 1 cm da parte inferior do gel. Uma vez que a eletroforese é concluída, transferir o gel para um transiluminador UV para visualizar fragmentos de DNA e padrão de peso molecular. Captura de imagem em filme Polaroid usando uma câmera Polaroid com laranja filtro de vidro (configurações: 2 x, y e 4,5) ou como uma imagem digital com uma câmera CCD e impressão com uma impressora térmica. Coloque os detentores capilar em lixívia a 10% por 15-30 min. Lave 3 vezes com dH 2 O e coloque de volta na sala de PCR de instalação para ar seco. 4. Representante Resultados Multiplex PCR Resultados para allelotyping PCR de Salmonella isolados de 10-10 são mostrados na Figura 1 (faixas 3-12) e interpretado como se segue. O alelo uma designação é dada para isolar Salmonella com base no amplicon (produto de PCR) correspondente em tamanho para o controle de PCR e, como previsto para o primer alelo O utilizados grupos (3): B-560bp, C1-340bp, C2-400 pb, D1-620 bp, e E1-280 bp. Para isolados testados com o allelotyping O PCR (Fig. 1A), atribuímos O alelos B (faixas de 10 -13), C1 (faixas 7-9), C2 (faixas 4, 5), D1 (faixa 3) e E1 (faixa 6) para a Salmonella dez isolados testados em pistas 12/03. Esses isolados foram testados Salmonella mesmo, na mesma ordem como Figo. 1A, para alelos H1 i; g, m; r; e z10 (Fig. 1B, C). Mais uma vez, um alelo H1 é atribuído a cada isolado dependente da presença de um amplicon de correspondência em tamanho para o controle de PCR e, como previsto para o primer alelo 4 H1 utilizados grupos (3): i-510 pb (Fig. 1B, pista 2 ); g, m-310 pb (Fig. 1B, pista 2); r-170 pb (Fig. 1C, pista 2) e z10-360 pb (Fig. 1C, pista 2). Alelos H1 foram atribuídos a um dos dez isolados Salmonella: i – os isolados 3 e 8 (Fig. 1B, pistas 5 e 10); g, m-os isolados 1 e 5 (Fig. 1B, faixas 3 e 7), para r isola 6 e 9 (Fig. 1C, faixas 8 e 11);. z10 e para os isolados 2, 7, e 10 (Fig. 1C, faixas 4, 9 e 12) isolar Salmonella 4 foi negativa para os quatro alelos H1 testados. Finalmente, os isolados de Salmonella foram testadas por PCR para alelos H2 associado com o 1,2, 1,5; 1,6; 1,7 complexo antígeno-e e, n, x; e, n, z15 complexo antígeno. O primer sets para o H2 1,2; 1,5; 1,6; 1,7 complexo e H2 e, n, x; e, n, z15 complexo produzir 290 bp e 150 bp amplicons, respectivamente (3). Os conjuntos de primer não é possível distinguir os alelos específicos dentro de H2 H2 antígeno complexo para atribuir um tipo de alelo definitiva, ex. 1,2, a um isolado (3) Salmonella isolados de 4, 6, 8-10 foram positivos para os alelos associados com H2 H2 1,2;. 1,5; 1,6; 1,7 complexo antígeno, enquanto que isolados 2 e 7 foram positivos para alelos H2 associados e, n, x; e, n, z15 complexo antígeno (dados não mostrados). Enquanto Salmonella isolados 1, 3 e 5 foram negativas para os dois complexos antígeno H2, apenas os isolados 1 e 5 foram negativas para flagelina H2, como determinado usando um genérico flagelina H2 PCR (1) (dados não mostram). Estes resultados são resumidos na Tabela 2, juntamente com o sorotipo Salmonella presuntivo atribuído a cada isolado. Figura 1. Multiplex PCR para identificação O Alelos específicos e H Associado com S. enterica Sorovares Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium. (A) O alelo Multiplex PCR. (B, C) Alelo H1 Multiplex PCR para identificação de Alelos flagelina: i / g, m (B) e r/z10 (C). Pistas 1 e 13: 100 bp ladder (Promega, Madison, WI); pista 2: controles multiplex PCR para alelos O B, C1, C2, D1 e E (A), H1 alelos i / g, m (B), e alelos H1 r/z10 (C); e pistas 12/03: Salmonella isolados de 1-10 (Tabela 2). PCR Master Mix Termociclador (Rapidcycler) Reagentes Composição / concentração Quantidade   Parâmetros Tamanho esperado H1 i / g, m dH 2 O 63 mL Programa 1 94 ° C por 1 min Tampão PCR 10X 20 mM MgCl 2 10 ml Programa 2 94 ° C por 1 s 500 mMTris PH8 55 ° C por 1 s 2,5 mg / ml BSA 72 ° C por 20 s 5% Ficoll 400 Para 40 ciclos 10 mMTartrazine Slope = 2,0 Primer i (f) * AACGAAATCAACAACAACCTGC 2 l Programa 3 72 ° C por 4 min 510 bp Primer i (r) * TAGCCATCTTTACCAGTTCCC 2 l Primer g, m (f) * GCAGCAGCACCGGATAAAG 2 l 310 bp Primer g, m (r) * CATTAACATCCGTCGCGCTAG 2 l DMSO 5 mL dNTP 10 mM 2 l Taq 5 unidades / mL 2 l 90 mL H1 r / z 10 dH 2 O 55 mL Programa 1 94 ° C por 1 min Tampão PCR 10X 30 mM MgCl 2 10 ml Programa 2 94 ° C por 1 s 500 mMTris PH8 55 ° C por 1 s 2,5 mg / ml BSA 72 ° C por 20 s 5% Ficoll 400 Para 40 ciclos 10 mMTartrazine Slope = 2,0 Primer r (f) * CCTGCTATTACTGGTGATC 4μl Programa 3 72 ° C por 4 min 170 bp Primer r (r) * GTTGAAGGGAAGCCAGCAG 4μl Primer z 10 (f) * GCACTGGCGTTACTCAATCTC 4μl 360 bp Primer z 10 (r) * GCATCAGCAATACCACTCGC 4μl DMSO 5 mL dNTP 10 mM 2 l Taq 5 unidades / mL 2 l 90 mL PCR Master Mix Termociclador (Rapidcycler) Reagentes Composição / concentração Quantidade   Parâmetros Tamanho esperado H2 1,2 / e, n, x dH 2 O 63,6 mL Programa 1 94 ° C por 1 min Tampão PCR 10X 20 mM MgCl 2 10 ml Programa 2 94 ° C por 1 s 500 mMTris PH8 55 ° C por 1 s 2,5 mg / ml BSA 72 ° C por 20 s 5% Ficoll 400 Para 40 ciclos 10 mMTartrazine Slope = 2,0 Primer 1,2 (f) * AGAAAGCGTATGATGTGAAA 2 l Programa 3 72 ° C por 4 min 290 bp Primer 1,2 (r) * ATTGTGGTTTTAGTTGCGCC 2 l Primer e, n, x (f) * TAACTGGCGATACATTGACTG 2 l 150 pb Primer e, n, x (r) 1 TAGCACCGAATGATACAGCC 2 l DMSO 5 mL dNTP 10 mM 2 l Taq 5 unidades / mL 2 l 90 mL Genéricos H2 dH 2 O 72 mL Programa 1 94 ° C por 1 min Tampão PCR 10X 30 mM MgCl 2 10 ml Programa 2 94 ° C por 10 s 500 mMTris PH8 45 ° C por 10 s 2,5 mg / ml BSA 72 ° C por 35 s 5% Ficoll 400 Para 40 ciclos 10 mMTartrazine Slope = 2,0 Primer fljB (f) * CAAGTAATCAACACTAACAGTC 2 l Programa 3 72 ° C por 4 min 1500 pb Primer fljB (r) * TTAACGTAACAGAGACAGCAC 2 l dNTP 10 mM 2 l Taq 5 unidades / mL 2 l 90 mL Tabela 1. Protocolo para Salmonella flagellinallelotyping PCR: composição, condições e resultados esperados. * A concentração de ações de trabalho de primers PCR é de 25 mM Isolar O alelo Alelo H1 Alelo H2 Sorovar   B C1 C2 D1 E Eu g, m r z10 1,2; 1,5; 1,6; 1,7 e, n, x; e, n, z15 Genérico 1   1 – – – + – – + – – – – – Enteritidis 2 – – + – – – – – + – + + Hadar / Istambul 3 3 – – + – – + – – – – – + Kentucky 4 – – – – + – – – – + – + Desconhecido 5 – + – – – – + – – – – – Montevidéu 6 – + – – – – – + – + – + Infantis ou Virchow 2 7 – + – – – – – – + – + + Mbandaka 8 + – – – – + – – – + – + Typhimurium 9 + – – – – – – + – + – </td> + Heidelberg 10 + – – – – – – – + + – + Haifa Tabela 2. Resultados Allelotyping PCR (Fig. 1) e Designação Salmonella Serovar Baseado em Identificação de O, H1, H2 e Alelos > 1 H2 PCR produz um amplicon 1,5 kb para todos Salmonella possuindo flagelina H2, independentemente do alelo H2 (1). Este PCR é usado para distinguir monofásico da Salmonella bifásico. 2 multiplex PCR H2 não pode distinguir entre os diferentes alelos para o H2 1,2; 1,5; 1,6; 1,7 complexo antígeno (3). 3 Phage conversão de S. enterica sorovar Hadar altera LPS antígeno O de produzir serovar Istambul. O allelotyping a PCR não pode discernir estas sutis mudanças genéticas / antigênica. Sorovar 1 O alelo Alelo H1 Alelo H2   B C1 C2 D1 E Eu g, m r z10 1,2; 1,5; 1,6; 1,7 e, n, x; e, n, z15 Genérica 2 Califórnia + – – – – – + – – – – – Typhimurium + – – – – + – – – + – + Heidelberg + – – – – – – + – + – + Haifa + – – – – – – – + + – + Montevidéu – + – – – – + – – + – + Othmarschen – + – – – – + – – – – – Atenas – + – – – + – – – – + + Papuana – + – – – – – + – – + + Mbandaka – + – – – – – – + – + + Chincol – – + – – – + – – – + + Kentucky – – + – – + – – – – – + Hadar / Istambul 3 – – + – – – – – + – + + Enteritidis – – – + – – + – – – – – Seremban – – – + – + – – – + – + Campinense – – – + – – – + – – + + Lome – – – + – – – + – – – + Portland – – – + – – – – + + – + Ruanda – – – + – – – – + – + + Treguier – – – + – – – – + – – + Simi – – – – + – – + – – + + Weltevreden – – – – + – – + – – – + Kristianstad – – – – + – – – + – + + Biafra – – – – + – – – + – – + Tabela 3. Salmonella enterica Sorovares identificados por PCR Allelotyping 1 Os sorovares destaque em negrito são as mais comumente encontradas por diagnóstico ou de laboratório da microbiologia alimentar. 2 H2 PCR produz um amplicon 1,5 kb para todos Salmonella possuindo flagelina H2, independentemente do alelo H2 (1). Este PCR é usado para distinguir monofásico da Salmonella bifásico. 3 Phage conversão de S. enterica sorovar Hadar altera LPS antígeno O de produzir serovar Istambul. O allelotyping a PCR não pode discernir estas sutis mudanças genéticas / antigênica.