Ein Allelotyping PCR zur Identifizierung Salmonella enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium

1. Vorbereitung von PCR-Vorlage Hinweis: Um PCR Verschleppung zu minimieren, ist es wichtig, einige wichtige wichtigsten Schritte in der PCR physikalisch voneinander getrennt zu halten: 1) Vorlage (DNA) Vorbereitung, 2) PCR-Setup, und 3) Gelelektrophorese. Es wird auch empfohlen, Barriere Tipps zu nutzen, um Kultur oder Reagenz Kontamination pipetters verhindern. Inoculate 1 ml Luria Bertani Brühe oder andere komplexe Medium (Brain Heart Infusion, Superbroth, etc.) mit Salmonella Isolat von einem einzelnen, isolierten Kolonie. Inkubieren Kultur über Nacht bei 37 ° C. Transfer 1 ml in eine sterile, 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Zentrifuge der bakteriellen Zellsuspension bei 4.500 xg für ca. 2 min. zu Pellet-Zellen. Dekantieren, Zellpellet in 1 ml 100% Ethanol und stellen bei Raumtemperatur für 10 min. Pellet-Zellen wie zuvor (4.500 xg, 2 min.), Entfernen Sie den Überstand und die Zellen in 1 ml PBS. Centrifuge Zellen (4.500 xg, 2 min.), Überstand verwerfen und die Zellen in 1 ml sterilem dH 2 O. Verdünnen Sie die endgültigen Zellsuspension 1 / 20 in dH 2 O (5 μl/95 ul dH 2 O) und bei -20 ° C. Die Haltbarkeit der ganzen Zellen als PCR-Template bei -20 ° C wird etwa einen Monat. 2. PCR-Setup Hinweis: Vorbereitung und Abgabe des PCR-Reaktionsmischung (Vorlage, Puffer, oligonucletoideprimers, Nukleotiden und Taq DNA Polymerase) muss in einem physisch getrennten Raum gewidmet und vorzugsweise erfolgt in einer PCR-/ UV-Workstation durchgeführt werden. Hinweis: Die PCR einzurichten Raum muss auch mit einem bestimmten -20 ° C Tiefkühltruhe für die Lagerung von PCR-Reagenzien (Puffer, Oligonukleotid-Primer und Nukleotide), Enzyme und Vorlage in sich geschlossene, engagierte Pipette für die PCR-Setup, Einweg-Latexhandschuhe gesetzt , Laborkittel, Pipettenspitzen, Mikrotiterplatten, Glaskapillaren Mikrozentrifugenröhrchen und 10% Bleichmittel zur Dekontamination von Oberflächen. Verwenden Sie einen dedizierten Pipette-Set (P10, P100 und P1000), um PCR-Reagenzien zu verzichten. Diese Pipette einstellen müssen nie verlassen das Set-up-Workstation. Hinweis: Erhalten Molekularbiologie oder PCR grade dH 2 O und 1 ml Aliquot in 1,5 ml Röhrchen. Dispense aliquotiert dH 2 O nach jedem Gebrauch, um mögliche Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Ein ähnlicher Ansatz wird mit den anderen PCR-Reagenzien empfohlen. Hinweis: Behandeln Sie den Arbeitsbereich vor der Anwendung mit UV-Beleuchtung und / oder Abwischen Oberflächen mit 10% Bleichmittel. Laborkittel tragen und Latex-Handschuhe bei der Durchführung PCR-Setup. Minimieren hin und her Datenverkehr von PCR-bis zu Gebieten, in denen die PCR-Reaktionen in der thermocylcer und PCR-Produkte (Amplikons) sind auf Agarosegelen getrennt inkubiert werden. Wenn Sie zurück in die PCR-up-Bereich gehen, der Paar Latexhandschuhe Sie derzeit tragen sind und auf ein neues Paar Handschuhe entsorgen. Machen Sie ein Master-Primer Lager in dH 2 O zu einer Konzentration von 5×10 -4 M. Verdünnen Sie die Primer 1 / 20 in dH 2 O (5 μl/95 ul dH 2 O, 25 M). Die Oligonukleotid-Sequenz für jedes Flagellin Eingabe Primer ist in Tabelle 1 beschrieben. Abrufen PCR-Reagenzien und Vorlage von -20 ° C Gefrierschrank und lassen Reagenzien und Proben zum Auftauen auf Eis. Verlassen Sie die Taq DNA Polymerase in Gefrierfach, bis sie benötigt. Dispense Reagenzien für die PCR-Reaktion allelotyping mischen, wie in Tabelle 1 beschrieben. Dispense 9μl der PCR-Reaktion-Mix in jeweils 10-förmigem Boden in eine sterile, 96-well, Polystyrol-Mikrotiterplatte, beginnend am oberen Rand der Spalte (zB A1) und bewegen Sie die Spalte an den Anfang der nächsten. Add 1 ul dH 2 O, um die 9 ul PCR-Mix (keine DNA-Steuerung) in die erste Vertiefung (A1), 0.5μl der positiven Kontrolle Vorlagen (i / g, m Tippen Primer-Typhimurium und Enteritidis, r/z10 Eingabe Primer-Heidelberg und Hadar; und 1,2 / e, n, x tippen Primer-Typhimurium und Hadar) bis 9 ul des PCR-Mix in der 2 nd gut (B1), und 1 ul Escherichia coli K12 DH5a die 9 ml PCR-Mix in der dritten und (C1). Für jede weitere gut (D1-H1; A2, B2), add 1 ul aufgetauten Proben Vorlage der 9 ul der PCR-Reaktion zu mischen. Für die i / g, m allelotyping PCR, S. enterica Serovar Typhimurium (i) und Enteritidis (g, m) dienen als positive Kontrollen und Salmonella-Serovare Heidelberg (r) und Hadar (z10) sind die positiven Kontrollen für die r / z 10 allelotyping Multiplex-PCR. Platz 10 ul Kapazität Glaskapillaren in dafür vorgesehenen Halterungen für die Idaho Technology Rapidcycler (8). einmal in der Halterung befestigt, laden jedes Glas mit der PCR-Reaktionsmischung Kapillare durch Berühren der Kapillare zurunteren Vertiefungen der Mikrotiterplatte. Kippen Sie die Halterung, damit die Flüssigkeit zu bewegen in den Schlauch und bieten Platz zwischen den Enden und der PCR-Mix vor Wärmeversiegelung die Glasröhren mit einem Butan-Fackel an beiden Enden der Kapillaren verschließen. Legen Sie die Kapillaren und Halter in den Idaho Technology Rapidcycler und verwenden Thermocycler-Programme in Tabelle 1 für die verschiedenen allelotyping beschriebenen Primer zur PCR-Lauf. Gehen Sie zur Gelelektrophorese Schritt, wenn das Thermocycler-Programm abgeschlossen ist. 3. Gel-Elektrophorese Hinweis: Tragen Sie eine andere Laborkittel für die Verwendung in Elektrophorese-Labor bezeichnet und ein neues Paar Einweg-Latexhandschuhe. Hinweis: Tragen Sie UV Schutzbrille Schutzbrille oder Gesichtsschutz und waren immer Handschuhe beim Umgang mit Ethidiumbromid, insbesondere Agarosegelen. Es werden 100 ml geschmolzenem 1,5% (w / v) Molekularbiologie Agarose in 1xTAE (oder 1X TBE) Elektrophorese-Puffer (7) durch wiederholtes Erhitzen der Agarose-Suspension in der Mikrowelle bei 20% Leistung für 2-5 min Abständen mit periodischen visuelle gesetzt Inspektion. Stellen Sie die geschmolzene Agarose in 60 ° C Wasserbad, bis es die Temperatur des Wasserbades im Gleichgewicht. Richten Sie die Gelform mit Kamm vor dem Gießen der geschmolzenen Agarose. Wählen Sie ein Gel Kamm mit genügend Zähne, um genügend Brunnen für Kontrollen, Proben, und mindestens 3 Molekulargewichts-Standards für ihre Platzierungen an den Enden und der Mitte des Agarosegel zu produzieren. Add 2 ul Ethidiumbromid (10 mg / ml) zu 100 ml geschmolzenem 1,5% (w / v) Agarose in 1xTAE (oder TBE), schwenken Flasche zu mischen, zu vermeiden Blasen entstehen, und gießen Sie leicht den Inhalt der Flasche in die Mitte des Gels Form für 15 von 10 cm Agarosegel. Verwenden Sie den Rand des Tissue-Papier oder ein Papiertuch, um Luftblasen in der Agarosegel zu entfernen. Lassen Sie das Gel Form bei Raumtemperatur bis Agarose erstarrt (~ 30-45 min) eingestellt. Übertragen Sie die Gelträger mit Gel & Kamm, um Tauch-, horizontale Elektrophorese-Kammer mit 1X TAE (oder 1X TBE) Elektrophorese-Puffer. Entfernen Sie vorsichtig den Kamm aus dem Agarosegel. Überprüfen Sie die Platzierung der Gelträger gegenüber der Kathode oder positive Pol der Elektrophoresekammer sicher sein, dieser Pol ist an der Unterseite des Gels. Hinweis: Denken Sie an die negativ geladenen DNA wandert in Richtung der Kathode (dh "ausführen, um red"). Premix 200 ul DNA Molekulargewichtsmarker (0,25 ug / ul) mit 40 ul 6X DNA Loading Dye. Last 4,8 ul der vorgemischten DNA Molecular Weight Marker XIV des ersten, mittleren und letzten Brunnen. Legen Sie jeden der PCR-Proben beginnend mit gut 2 und Weiterentwicklung, um jede weitere gut, von links nach rechts. Vermeiden Sie das Laden der Probe in eine der Vertiefungen mit dem Molekulargewicht-Standard. So laden Proben in jedem Glaskapillare enthalten: Entfernen Sie jede Kapillare aus der Halterung und etch beiden Enden der Kapillare mit einem Glasschneider. Legen Sie Daumen und Zeigefinger beider Hände auf beiden Seiten der Kapillare durch die Glasschneider markiert und lassen Sie die Kapillare. Legen Sie die Kapillare Spender auf dem gegenüberliegenden Ende der PCR-Reaktion zu mischen und langsam den Kolben im Uhrzeigersinn, bis die Flüssigkeit am unteren Ende des Rohres. Legen Sie die Kapillare in den Brunnen zu beladen und langsam drehen Sie den Kolben im Uhrzeigersinn, um die Ficoll-Einwaage in die Agarose gut verzichten. Achten Sie darauf, Punktion der gut mit der Kapillare oder einführen, eine Luftblase in den Brunnen, indem zu viel Vergangenheit, als der letzte der Flüssigkeit verlässt die Kapillare. Nachdem alle Proben und Standards geladen sind, stellen Sie die konstante Spannung des Netzteils bis 90 V (9 Volt / cm Agarosegel). Unterbrechen Elektrophorese einmal den gelben Farbstoff (Taurazine) Front ist 1 cm von der Unterseite des Gels. Nach Elektrophorese beendet ist, übertragen Sie die Gel auf einem UV-Transilluminator mit DNA-Fragmenten und dem Molekulargewicht Standard zu visualisieren. Capture-Bild auf Polaroid-Film mit einer Polaroid-Kamera mit orangen Glasfilter (Einstellungen: 2 x und 4,5 y) oder als digitales Bild mit einer CCD-Kamera und Druckbild mit einem Thermodrucker. Legen Sie die Kapillare Inhaber in 10% Bleichmittel für 15-30 min. Spülen Sie 3-mal mit dH 2 O und Ort zurück in PCR Setup Zimmer an der Luft trocknen. 4. Vertreter Multiplex PCR Ergebnisse Ergebnisse für allelotyping PCR von Salmonella-Isolaten 1-10 in Abbildung 1 (Bahnen 3-12) gezeigt und wie folgt interpretiert. Ein O-Allels Bezeichnung ist auf Salmonellen gegeben isolieren auf Amplikon (PCR-Produkt) passend in der Größe der PCR-Kontrolle basiert und für die O-Allel Primer vorhergesagt Sets verwendet (3): B-560bp, C1-340bp, C2-400 bp, D1-620 bp, und E1-280 bp. Für Isolate mit dem O allelotyping PCR (Abb. 1A), wir vergeben O Allele B (Bahnen 10 getestet -13), C1 (Spuren 7-9), C2 (Bahnen 4, 5), D1 (Spur 3) und E1 (Spur 6) zu den zehn Salmonella-Isolate getestet in den Spuren 3-12. Dieselben Salmonella-Isolate getestet wurden, in der gleichen Reihenfolge wie in Abb.. 1A, für H1-Allele i; g, m, r, und z10 (Abb. 1B, C). Wieder ein H1-Allel ist jede zugewiesene isolieren abhängig von der Anwesenheit eines Amplikons Matching in der Größe der PCR-Steuerung und für die 4 H1-Allel Primer vorhergesagt Sets verwendet (3): i-510 bp (Abb. 1B, Spur 2 ); g, m-310 bp (Abb. 1B, Spur 2); r-170 bp (Abb. 1C, Spur 2) und z10-360 bp (Abb. 1C, Spur 2). H1-Allele wurden zu einem der zehn Salmonella-Isolate zugeordnet: i – Isolaten 3 und 8 (Abb. 1B, Spuren 5 und 10); g, m-Isolaten 1 und 5 (Abb. 1B, Bahnen 3 und 7), r zu Isolaten 6 und 9 (Abb. 1C, Spur 8 und 11);. und z10 zu Isolaten 2, 7, und 10 (Abb. 1C, Spuren 4, 9, und 12) Salmonellen isolieren 4 wurde für die vier H1-Allele negativ getestet. Schließlich wurden Salmonella-Isolate mittels PCR für H2-Allele mit der 1,2 assoziiert getestet; 1,5; 1,6; 1,7 Antigen-Komplex und e, n, x, e, n, z15 Antigen-Komplex. Die Primer-Sets für die H2 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 komplex und H2 e, n, x, e, n, z15 komplexen produzieren 290 bp und 150 bp Amplifikate, bzw. (3). Die Primer-Sets nicht unterscheiden kann, spezifische H2-Allele in beiden H2-Antigen-Komplex zu einer endgültigen Allel-Typ, ex zuweisen. 1,2, zu einer Isolierung (3) Salmonella-Isolate 4, 6, 8-10 positiv für H2-Allele mit H2 1,2 verbunden waren;. 1,5; 1,6; 1,7 Antigen-Komplex, während Isolate 2 und 7 wurden für H2-Allele mit e, n, x verbundene positive, e, n, z15 Antigen-Komplex (Daten nicht gezeigt). Während Salmonella-Isolate 1, 3 und 5 wurden für die beiden H2-Antigen-Komplexe negativ, nur vereinzelt 1 und 5 wurden für H2 Flagellin negativ, wie unter Verwendung eines generischen H2 Flagellin PCR (1) (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammen mit dem mutmaßlichen Salmonella Serovar zugeordnet jedes Isolat zusammengefasst. Abbildung 1. Multiplex PCR zur ​​Identifizierung spezifischer O-und H-Allele mit S. Assoziierte enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium. (A) O Allele Multiplex PCR. (B, C) H1 Allele Multiplex PCR zur Identifizierung Flagellin Allele: i / g, m (B) und r/z10 (C). Lanes 1 und 13: 100 bp Leiter (Promega; Madison, WI), Spur 2: Multiplex-PCR-Kontrollen für O-Allele B, C1, C2, D1 und E (A), Allele H1 i / g, m (B), und H1-Allele r/z10 (C); und Gassen 3-12: Salmonella-Isolate 1-10 (Tabelle 2). PCR Master Mix Thermocycler (Rapidcycler) Reagenzien Zusammensetzung / Konzentration Betrag   Parameters Erwartete Größe H1 i / g, m dH 2 O 63 ul Programm 1 94 ° C für 1 min 10x PCR-Puffer 20 mM MgCl 2 10 pl Programm 2 94 ° C für 1 s 500 mM Tris pH 8 55 ° C für 1 s 2,5 mg / ml BSA 72 ° C für 20 s 5% Ficoll 400 Für 40 Zyklen 10 mMTartrazine Slope = 2,0 Primer i (f) * AACGAAATCAACAACAACCTGC 2 ul Programm 3 72 ° C für 4 min 510 bp Primer i (r) * TAGCCATCTTTACCAGTTCCC 2 ul Primer g, m (f) * GCAGCAGCACCGGATAAAG 2 ul 310 bp Primer g, m (r) * CATTAACATCCGTCGCGCTAG 2 ul DMSO 5 pl dNTP 10 mM 2 ul Taq 5 Einheiten / ul 2 ul 90 ul H1 r / z 10 dH 2 O 55 ul Programm 1 94 ° C für 1 min 10x PCR-Puffer 30 mM MgCl 2 10 pl Programm 2 94 ° C für 1 s 500 mM Tris pH 8 55 ° C für 1 s 2,5 mg / ml BSA 72 ° C für 20 s 5% Ficoll 400 Für 40 Zyklen 10 mMTartrazine Slope = 2,0 Primer r (f) * CCTGCTATTACTGGTGATC 4μl Programm 3 72 ° C für 4 min 170 bp Primer r (r) * GTTGAAGGGAAGCCAGCAG 4μl Primer z 10 (f) * GCACTGGCGTTACTCAATCTC 4μl 360 bp Primer z 10 (r) * GCATCAGCAATACCACTCGC 4μl DMSO 5 pl dNTP 10 mM 2 ul Taq 5 Einheiten / ul 2 ul 90 ul PCR Master Mix Thermocycler (Rapidcycler) Reagenzien Zusammensetzung / Konzentration Betrag   Parameters Erwartete Größe H2 1,2 / e, n, x dH 2 O 63,6 ul Programm 1 94 ° C für 1 min 10x PCR-Puffer 20 mM MgCl 2 10 pl Programm 2 94 ° C für 1 s 500 mM Tris pH 8 55 ° C für 1 s 2,5 mg / ml BSA 72 ° C für 20 s 5% Ficoll 400 Für 40 Zyklen 10 mMTartrazine Slope = 2,0 Primer 1,2 (f) * AGAAAGCGTATGATGTGAAA 2 ul Programm 3 72 ° C für 4 min 290 bp Primer 1,2 (r) * ATTGTGGTTTTAGTTGCGCC 2 ul Primer e, n, x (f) * TAACTGGCGATACATTGACTG 2 ul 150 bp Primer e, n, x (r) 1 TAGCACCGAATGATACAGCC 2 ul DMSO 5 pl dNTP 10 mM 2 ul Taq 5 Einheiten / ul 2 ul 90 ul Generische H2 dH 2 O 72 ul Programm 1 94 ° C für 1 min 10x PCR-Puffer 30 mM MgCl 2 10 pl Programm 2 94 ° C für 10 s 500 mM Tris pH 8 45 ° C für 10 s 2,5 mg / ml BSA 72 ° C für 35 s 5% Ficoll 400 Für 40 Zyklen 10 mMTartrazine Slope = 2,0 Primer fljB (f) * CAAGTAATCAACACTAACAGTC 2 ul Programm 3 72 ° C für 4 min 1.500 bp Primer fljB (r) * TTAACGTAACAGAGACAGCAC 2 ul dNTP 10 mM 2 ul Taq 5 Einheiten / ul 2 ul 90 ul Tabelle 1. Protokoll für Salmonellen flagellinallelotyping PCR: Zusammensetzung, Bedingungen und erwarteten Ergebnisse. * Die Arbeitsgruppe Lager Konzentration der PCR-Oligonukleotid-Primer ist 25 uM Isolieren O Allele H1 Allele H2 Allele Serovar   B C1 C2 D1 E ich g, m r z10 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 e, n, x, e, n, z15 Generische 1   1 – – – + – – + – – – – – Enteritidis 2 – – + – – – – – + – + + Hadar / Istanbul 3 3 – – + – – + – – – – – + Kentucky 4 – – – – + – – – – + – + Unbekannt 5 – + – – – – + – – – – – Montevideo 6 – + – – – – – + – + – + Infantis oder Virchow 2 7 – + – – – – – – + – + + Mbandaka 8 + – – – – + – – – + – + Typhimurium 9 + – – – – – – + – + – </td> + Heidelberg 10 + – – – – – – – + + – + Haifa Tabelle 2. Allelotyping PCR Ergebnisse (Abb. 1) und Salmonella Serovar Bezeichnung auf der Identifizierung von O, H1 und H2 Allelen > 1 H2 PCR erzeugt ein 1,5 kb Amplikon für alle Salmonella besitzen H2 Flagellin, unabhängig von H2-Allels (1). Diese PCR wird verwendet, um monophasischen aus der zweiphasigen Salmonellen zu unterscheiden. 1,5;; 1,6; 1,7 Antigen-Komplex (3) 2 H2 Multiplex-PCR kann nicht zwischen den verschiedenen Allele für die H2 1,2 unterscheiden. 3 Phage Umwandlung von S. enterica Serovar Hadar verändert LPS O Antigen Serovar Istanbul produzieren. Die O allelotyping PCR kann nicht erkennen, diese subtilen genetischen / antigenen Veränderungen. Serovar 1 O Allele H1 Allele H2 Allele   B C1 C2 D1 E ich g, m r z10 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 e, n, x, e, n, z15 Generische 2 Kalifornien + – – – – – + – – – – – Typhimurium + – – – – + – – – + – + Heidelberg + – – – – – – + – + – + Haifa + – – – – – – – + + – + Montevideo – + – – – – + – – + – + Othmarschen – + – – – – + – – – – – Athinai – + – – – + – – – – + + Papuana – + – – – – – + – – + + Mbandaka – + – – – – – – + – + + Chincol – – + – – – + – – – + + Kentucky – – + – – + – – – – – + Hadar / Istanbul 3 – – + – – – – – + – + + Enteritidis – – – + – – + – – – – – Seremban – – – + – + – – – + – + Campinense – – – + – – – + – – + + Lome – – – + – – – + – – – + Portland – – – + – – – – + + – + Ruanda – – – + – – – – + – + + Treguier – – – + – – – – + – – + Simi – – – – + – – + – – + + Weltevreden – – – – + – – + – – – + Kristianstad – – – – + – – – + – + + Biafra – – – – + – – – + – – + Tabelle 3. Salmonella enterica Serovare von Allelotyping PCR identifiziert 1 Die Serovare in Fettdruck hervorgehoben sind diejenigen, häufiger von Diagnose-oder Lebensmittel-Mikrobiologie-Labor gestoßen. 2 H2 PCR erzeugt ein 1,5 kb Amplikon für alle Salmonella besitzen H2 Flagellin, unabhängig von H2-Allels (1). Diese PCR wird verwendet, um monophasischen aus der zweiphasigen Salmonellen zu unterscheiden. 3 Phage Umwandlung von S. enterica Serovar Hadar verändert LPS O Antigen Serovar Istanbul produzieren. Die O allelotyping PCR kann nicht erkennen, diese subtilen genetischen / antigenen Veränderungen.