Un Allelotyping PCR per l'identificazione Salmonella enterica Sierotipi Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium

1. Preparazione del modello di PCR Nota: Al fine di minimizzare la contaminazione PCR riporto, è importante mantenere alcuni passi importanti chiave nella PCR fisicamente separati gli uni dagli altri: 1) modello (DNA) preparazione, 2) preparazione della PCR, e 3) elettroforesi su gel. Si raccomanda inoltre di utilizzare punte barriera al fine di prevenire la contaminazione della cultura o reagente di pipetters. Seminare 1 ml di brodo Luria Bertani o altro supporto di complessi (Heart Infusion Cervello, Superbroth, ecc) con Salmonella isolare da una singola colonia isolata. Incubare cultura overnight a 37 ° C. Trasferire 1 ml ad una sterile, provetta da microcentrifuga 1,5 ml, centrifugare la sospensione batterica delle cellule a 4.500 xg per ~ 2 min. alle cellule pellet. Decantare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 ml di etanolo al 100% e fissato a temperatura ambiente per 10 min. Cellule pellet come prima (4.500 xg, 2 min.), Rimuovere le cellule supernatante e risospendere in 1 ml di PBS. Centrifugare le cellule (4.500 xg, 2 min.), Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di soluzione sterile dH 2 O. Diluire la sospensione definitiva delle cellule 1 / 20 in dH 2 O (5 μl/95 microlitri dH 2 O) e conservare a -20 ° C. La validità del modello di cellule intere, come la PCR a -20 ° C è di circa un mese. 2. PCR Setup Nota: La preparazione e la distribuzione della miscela di reazione PCR (modello, tamponi, oligonucletoideprimers, nucleotidi e polimerasi Taq DNA) deve essere eseguita in un locale separato dedicato fisicamente e preferibilmente fatto in una stazione di lavoro PCR / UV. Nota: L'impostazione della PCR camera deve essere autosufficiente con una designato congelatore -20 ° C per la conservazione di reagenti PCR (tamponi, primer oligonucleotidi, e nucleotidi), enzimi e modello, pipetter dedicato impostare per l'impostazione della PCR, guanti in lattice usa e getta , camice da laboratorio, consigli barriera, micropiastre, capillari di vetro, tubi microcentrifuga, e il 10% di candeggina per decontaminare superfici. Utilizzare un set dedicato pipetter (P10, P100, P1000 e) di dispensare i reagenti PCR. Questo set pipetta non deve mai lasciare il set-up della workstation. Nota: Ottenere biologia molecolare o PCR grado dH 2 O e aliquote da 1 ml in provette da 1,5 ml centrifuga. Dispensare aliquotate dH 2 O dopo ogni uso per evitare possibili contaminazioni crociate. Un approccio simile è consigliato con i reagenti altri PCR. Nota: Decontaminare l'area di lavoro prima dell'uso con illuminazione UV e / o pulire le superfici con il 10% di candeggina. Indossare camice da laboratorio e guanti in lattice nello svolgimento preparazione della PCR. Minimizzare avanti e indietro il traffico proveniente da PCR set-up per le aree in cui vengono incubate le reazioni PCR in thermocylcer e prodotti di PCR (ampliconi) sono separati su gel di agarosio. Se si va indietro nel set-up zona PCR, smaltire il paio di guanti in lattice che si sta indossando e messo su un nuovo paio di guanti. Fai uno stock fondo master in dH 2 o ad una concentrazione di 5×10 -4 M. Diluire il primer 1 / 20 in dH 2 O (5 μl/95 microlitri dH 2 °, 25 mM). La sequenza di oligonucleotidi per ciascun primer digitando flagellina è descritto nella tabella 1. Recuperare reagenti PCR e il modello da -20 ° C freezer, e permettere reagenti ei campioni a scongelare sul ghiaccio. Lasciare la DNA polimerasi Taq in freezer fino al momento dell'uso. Dispensare reagenti per mix allelotyping reazione PCR come descritto nella Tabella 1. Erogare 9μl della miscela di reazione PCR in ciascuno dei 10 pozzetti circolari in una sterile, a 96 pozzetti, piastra di microtitolazione in polistirene, a partire dalla parte superiore della colonna (es. A1) e spostando la colonna in alto di quella successiva. Aggiungere 1 ml di dH 2 O al microlitri 9 di PCR mix (nessun controllo del DNA) per il primo pozzo (A1), 0.5μl dei modelli di controllo positivo (i / g, m digitando primer-Enteritidis e Typhimurium; r/z10 digitando primer-Heidelberg e Hadar, e 1,2 / e, n, x digitando primer-e Typhimurium Hadar) a 9 ml di mix di PCR nel 2 ° e (B1) e 1 ml di Escherichia coli K12 DH5α al 9 ml di mix di PCR nel terzo pozzo (C1). Per ogni ulteriore bene (D1-H1; A2, B2), aggiungere 1 ml del modello campione scongelato al microlitri 9 della miscela di reazione PCR. Per i / g, m allelotyping PCR, S. enterica sierotipo Typhimurium (i) e Enteritidis (g, m) servono come controlli positivi, e sierotipi di Salmonella Heidelberg (r) e Hadar (z10) sono i controlli positivi per il r / z 10 allelotyping multiplex PCR. Place 10 microlitri capacità capillari in vetro titolari designati per la Tecnologia Idaho Rapidcycler (8). una volta fissato nel supporto, caricare ogni capillare di vetro con la miscela di reazione PCR toccando il capillare alpozzi fondo della micropiastra. Inclinare il supporto per consentire al liquido di spostare verso il basso il tubo e prevedere uno spazio tra le estremità e il mix di PCR prima termosaldatrici i tubi di vetro con una torcia butano per sigillare entrambe le estremità dei capillari. Posizionare i tubi capillari e supporto nel Tecnologia Idaho Rapidcycler e utilizzare programmi termociclatore descritte nella Tabella 1 per il primer allelotyping diversi per eseguire la PCR. Passare al punto gel elettroforesi quando il programma termociclatore è stato completato. 3. Gel elettroforesi Nota: Indossare un camice diverso laboratorio designato per l'uso in laboratorio elettroforesi e un nuovo paio di guanti in lattice usa e getta. Nota: Indossare occhiali di protezione UV o schermo protettivo e sempre sono stati i guanti quando si maneggiano bromuro di etidio, in particolare gel di agarosio. Preparare 100 ml fuso 1,5% (w / v) di biologia molecolare in grado di agarosio 1xTAE (o 1X TBE) buffer di elettroforesi (7) da riscaldamento ripetutamente la sospensione di agarosio nel forno a microonde fissato al 20% di potenza per 2-5 minuti con intervalli periodici visive ispezione. Impostare il fuso agarosio in 60 bagno ° C acqua fino a che equilibra la temperatura del bagno d'acqua. Impostare lo stampo gel con pettine prima di versare il fuso agarosio. Scegli un pettine a denti gel sufficiente a produrre abbastanza pozzi per i controlli, campioni, e almeno 3 standard di peso molecolare per i loro piazzamenti alle estremità e al centro del gel di agarosio. Aggiungere 2 ml di bromuro di etidio (10 mg / ml) a 100 ml di fuso 1,5% (w / v) agarosio in 1xTAE (o TBE), delicatamente bottiglia agitare, evitare di produrre bolle, e delicatamente versare il contenuto della bottiglia al centro dello stampo gel per 15 per 10 cm gel. Usare il bordo della carta velina o un fazzoletto di carta per rimuovere eventuali bolle nel gel di agarosio. Lasciatevi plasmare gel fissato a temperatura ambiente fino agarosio solidifica (~ 30-45 min). Trasferire il vassoio gel con gel e pettine per sommergibili, camera di elettroforesi orizzontale contenente 1X TAE (o 1X TBE) buffer di elettroforesi. Rimuovere delicatamente il pettine dal gel di agarosio. Verificare il posizionamento del vassoio gel rispetto al catodo o polo positivo della camera di elettroforesi per essere sicuri che questo polo si trova in fondo del gel. Nota: Ricordate il DNA, carico negativamente migra verso il catodo (cioè, "correre al rosso"). Premix 200 ml di marcatori di peso molecolare del DNA (0,25 mg / mL) con 40 ml di Loading Dye 6X DNA. Carico di 4,8 microlitri della premiscelati peso molecolare del DNA Marker XIV al primo, pozzi e l'ultimo mezzo. Carico ciascuno dei campioni PCR a partire da ben 2 e avanzando in ogni pozzetto successivo, passando da sinistra a destra. Evitare di caricare il campione in uno dei pozzetti contenenti lo standard peso molecolare. Per caricare i campioni contenuti in ogni capillare di vetro: Rimuovere ogni capillare dal suo supporto e etch entrambe le estremità del capillare con un cutter di vetro. Posizionare il pollice e l'indice di entrambe le mani su entrambi i lati del capillare segnato dalla lama di vetro e far scattare il capillare. Posizionare il distributore capillare sul lato opposto fine della miscela di reazione PCR e ruotare lentamente il pistone in senso orario fino a quando il liquido si trovi sul fondo della provetta. Mettere il capillare nel pozzo da caricare e ruotare lentamente il pistone in senso orario per erogare il Ficoll-ponderata campione nel agarosio bene. Fare attenzione a non forare il bene con il capillare o introdurre una bolla d'aria nel pozzo girando troppo passato, quando l'ultimo dei liquidi lascia il capillare. Una volta che tutti i campioni e gli standard sono stati caricati, impostare la tensione costante del sistema di alimentazione a 90 V (9 volts / cm gel). Interrompere l'elettroforesi una volta che il colorante giallo (Taurazine) frontale è di 1 cm dal fondo del gel. Una volta completata l'elettroforesi, trasferire il gel per un transilluminatore UV per visualizzare frammenti di DNA e standard di peso molecolare. Blocchi l'immagine su pellicola Polaroid utilizzando una macchina fotografica Polaroid con arancia vetro filtro (impostazioni: 2 x, y e 4,5) o come immagine digitale utilizzando una telecamera CCD e l'immagine stampata con una stampante termica. Posizionare i titolari capillare nel 10% di candeggina per 15-30 min. Lavare 3 volte con dH 2 O e il luogo di nuovo in camera preparazione della PCR asciugare all'aria. 4. Rappresentante PCR multiplex Risultati Risultati per allelotyping PCR di isolati di Salmonella 1-10 sono mostrati in figura 1 (corsie 3-12) e interpretato nel modo seguente. Una designazione allele O è dato a isolare Salmonella in base amplicone (prodotto PCR) corrispondenti per dimensioni a controllo PCR e come previsto per il primer allele O set utilizzati (3): B-560bp, C1-340bp, C2-400 bp, D1-620 bp, e E1-280 bp. Per isolati testati con il allelotyping O PCR (Fig. 1A), abbiamo assegnato O alleli B (corsia 10 -13), C1 (corsie 7-9), C2 (corsie 4, 5), D1 (corsia 3), ed E1 (corsia 6) per la Salmonella dieci isolati testati in corsie 3-12. Questi isolati di Salmonella stessi sono stati testati, nello stesso ordine di fig. 1A, per alleli H1 i; g, m, r, e z10 (Fig. 1B, C). Ancora una volta, un allele H1 è assegnato a ciascun isolare dipende dalla presenza di un amplicone di corrispondenza di dimensioni al controllo PCR e come previsto per il primer allele 4 H1 set utilizzati (3): i-510 bp (Fig. 1B, corsia 2 ), g, m-310 bp (Fig. 1B, corsia 2), r-170 bp (Fig. 1C, corsia 2) e z10-360 bp (Fig. 1C, corsia 2). Alleli H1 sono stati assegnati ad uno dei dieci isolati di Salmonella: i – isola 3 e 8 (Fig. 1B, corsie 5 e 10), g, m-isola 1 e 5 (Fig. 1B, corsie 3 e 7), r per isola 6 e 9 (Fig. 1C, corsie 8 e 11);. z10 e agli isolati 2, 7, e 10 (Fig. 1C, corsie 4, 9, e 12) Salmonella isolare 4 è stata negativa per i quattro alleli H1 testati. Infine, isolati di Salmonella sono stati testati con PCR per H2 alleli associati al 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 e complessi antigene e, n, x, e, n, Z15 complesso antigene. Il primer set per l'H2 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 complesso e H2 e, n, x, e, n, Z15 complesso producono 290 bp e 150 bp amplificati, rispettivamente (3). I set di fondo non può distinguere specifici alleli H2 all'interno dell'uno o antigene H2 complesso di assegnare un tipo di allele definitiva, ex. 1,2, a un isolato (3) isolati di Salmonella 4, 6, 8-10 sono risultati positivi per gli alleli associati a H2 H2 1,2;. 1,5, 1,6, 1,7 complesso antigene, mentre isola 2 e 7 sono risultati positivi per gli alleli associati a H2 e, n, x, e, n, Z15 complessi antigene (dati non riportati). Mentre isolati di Salmonella 1, 3 e 5 sono risultati negativi per i due complessi antigene H2, isola solo 1 e 5 sono risultati negativi per H2 flagellina, come determinato mediante un generico H2 flagellina PCR (1) (dati non dimostrano). Questi risultati sono riassunti nella Tabella 2, nonché il sierotipo di Salmonella presuntivo assegnato a ogni isolato. Figura 1. Multiplex PCR per identificare specifici O e H alleli associati con S. enterica sierotipi Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium. (A) O alleliche Multiplex PCR. (B, C) H1 alleliche Multiplex PCR per identificare gli alleli flagellina: i / g, m (B) e r/z10 (C). Corsie 1 e 13: 100 scala bp (Promega, Madison, WI), corsia 2: controlli multiplex PCR per alleli O B, C1, C2, D1 e E (A), H1 alleli i / g, m (B), e alleli H1 r/z10 (C) e corsie 3-12: isolati di Salmonella 1-10 (Tabella 2). PCR Master Mix Termociclatore (Rapidcycler) Reagenti Composizione / concentrazione Quantità   Parametri Dimensione attesi H1 i / g, m dH 2 O 63 microlitri Programma 1 94 ° C per 1 min 10X PCR buffer di 20 mM MgCl 2 10 microlitri Programma 2 94 ° C per 1 s 500 mMTris pH8 55 ° C per 1 s 2,5 mg / ml di BSA 72 ° C per 20 s 5% Ficoll 400 Per 40 cicli 10 mMTartrazine Pendenza = 2,0 Primer i (t) * AACGAAATCAACAACAACCTGC 2 microlitri Programma 3 72 ° C per 4 min 510 bp Primer i (r) * TAGCCATCTTTACCAGTTCCC 2 microlitri Primer G, M (f) * GCAGCAGCACCGGATAAAG 2 microlitri 310 bp Primer G, M (r) * CATTAACATCCGTCGCGCTAG 2 microlitri DMSO 5 microlitri dNTP 10 mM 2 microlitri Taq 5 unità / mL 2 microlitri 90 microlitri H1 r / z 10 dH 2 O 55 microlitri Programma 1 94 ° C per 1 min 10X PCR buffer di 30 mM MgCl 2 10 microlitri Programma 2 94 ° C per 1 s 500 mMTris pH8 55 ° C per 1 s 2,5 mg / ml di BSA 72 ° C per 20 s 5% Ficoll 400 Per 40 cicli 10 mMTartrazine Pendenza = 2,0 Primer r (f) * CCTGCTATTACTGGTGATC 4μl Programma 3 72 ° C per 4 min 170 bp Primer r (r) * GTTGAAGGGAAGCCAGCAG 4μl Primer z 10 (f) * GCACTGGCGTTACTCAATCTC 4μl 360 bp Primer z 10 (r) * GCATCAGCAATACCACTCGC 4μl DMSO 5 microlitri dNTP 10 mM 2 microlitri Taq 5 unità / mL 2 microlitri 90 microlitri PCR Master Mix Termociclatore (Rapidcycler) Reagenti Composizione / concentrazione Quantità   Parametri Dimensione attesi H2 1,2 / e, n, x dH 2 O 63,6 microlitri Programma 1 94 ° C per 1 min 10X PCR buffer di 20 mM MgCl 2 10 microlitri Programma 2 94 ° C per 1 s 500 mMTris pH8 55 ° C per 1 s 2,5 mg / ml di BSA 72 ° C per 20 s 5% Ficoll 400 Per 40 cicli 10 mMTartrazine Pendenza = 2,0 Primer 1,2 (f) * AGAAAGCGTATGATGTGAAA 2 microlitri Programma 3 72 ° C per 4 min 290 bp Primer 1,2 (r) * ATTGTGGTTTTAGTTGCGCC 2 microlitri Primer e, n, x (f) * TAACTGGCGATACATTGACTG 2 microlitri 150 bp Primer e, n, x (r) 1 TAGCACCGAATGATACAGCC 2 microlitri DMSO 5 microlitri dNTP 10 mM 2 microlitri Taq 5 unità / mL 2 microlitri 90 microlitri Generico H2 dH 2 O 72 microlitri Programma 1 94 ° C per 1 min 10X PCR buffer di 30 mM MgCl 2 10 microlitri Programma 2 94 ° C per 10 s 500 mMTris pH8 45 ° C per 10 s 2,5 mg / ml di BSA 72 ° C per 35 s 5% Ficoll 400 Per 40 cicli 10 mMTartrazine Pendenza = 2,0 Primer fljB (f) * CAAGTAATCAACACTAACAGTC 2 microlitri Programma 3 72 ° C per 4 min 1.500 bp Primer fljB (r) * TTAACGTAACAGAGACAGCAC 2 microlitri dNTP 10 mM 2 microlitri Taq 5 unità / mL 2 microlitri 90 microlitri Tabella 1. Protocollo per Salmonella flagellinallelotyping PCR: composizione, condizioni, e risultati attesi. * La concentrazione di borsa che lavorano di primer oligonucleotidi PCR è di 25 mM Isolare O alleliche H1 alleliche H2 alleliche Sierotipo   B C1 C2 D1 E Io g, m r z10 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 e, n, x, e, n, Z15 Generico 1   1 – – – + – – + – – – – – Enteritidis 2 – – + – – – – – + – + + Hadar / Istanbul 3 3 – – + – – + – – – – – + Kentucky 4 – – – – + – – – – + – + Sconosciuto 5 – + – – – – + – – – – – Montevideo 6 – + – – – – – + – + – + Infantis o Virchow 2 7 – + – – – – – – + – + + Mbandaka 8 + – – – – + – – – + – + Typhimurium 9 + – – – – – – + – + – </td> + Heidelberg 10 + – – – – – – – + + – + Haifa Tabella 2. Allelotyping Risultati PCR (Fig. 1) e Salmonella serovar Designazione Sulla base di Identificazione di O, H1, H2 e alleli > 1 H2 PCR produce un amplicone 1,5 kb per tutti Salmonella in possesso di H2 flagellina, indipendentemente allele H2 (1). Questo PCR è utilizzato per distinguere monofasici dalla Salmonella bifasica. 2 H2 PCR multiplex non può distinguere tra i diversi alleli per l'H2 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 complesso antigene (3). 3 Phage conversione di S. enterica serovar Hadar altera LPS O antigene per produrre sierotipo Istanbul. L'O allelotyping PCR non può discernere queste sottili variazioni genetiche / antigenica. Sierotipo 1 O alleliche H1 alleliche H2 alleliche   B C1 C2 D1 E Io g, m r z10 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 e, n, x, e, n, Z15 Generico 2 California + – – – – – + – – – – – Typhimurium + – – – – + – – – + – + Heidelberg + – – – – – – + – + – + Haifa + – – – – – – – + + – + Montevideo – + – – – – + – – + – + Othmarschen – + – – – – + – – – – – Athinai – + – – – + – – – – + + Papuana – + – – – – – + – – + + Mbandaka – + – – – – – – + – + + Chincol – – + – – – + – – – + + Kentucky – – + – – + – – – – – + Hadar / Istanbul 3 – – + – – – – – + – + + Enteritidis – – – + – – + – – – – – Seremban – – – + – + – – – + – + Campinense – – – + – – – + – – + + Lome – – – + – – – + – – – + Portland – – – + – – – – + + – + Ruanda – – – + – – – – + – + + Treguier – – – + – – – – + – – + Simi – – – – + – – + – – + + Weltevreden – – – – + – – + – – – + Kristianstad – – – – + – – – + – + + Biafra – – – – + – – – + – – + Tabella 3. Salmonella enterica sierotipi identificati dal Allelotyping PCR 1 Il sierotipi evidenziati in grassetto sono quelli più comunemente incontrati dai diagnostici o di laboratorio microbiologia alimentare. 2 H2 PCR produce un amplicone 1,5 kb per tutti Salmonella in possesso di H2 flagellina, indipendentemente allele H2 (1). Questo PCR è utilizzato per distinguere monofasici dalla Salmonella bifasica. 3 Phage conversione di S. enterica serovar Hadar altera LPS O antigene per produrre sierotipo Istanbul. L'O allelotyping PCR non può discernere queste sottili variazioni genetiche / antigenica.