Padronização de plasma de superfície litografia para a Criação de Redes de celular

1. Criação de moldes usados ​​para modelar Projeto conceitual de padrões. Padrões são criados que servem para formar redes de celular, entre em contato célula de controle, isolar as células, imitam estruturas naturais, ou guia de adesão celular e posicionamento. Computer-aided design ou criação de CAD baseado em padrões e criação de fotomáscara. O padrão desejado é projetado em software CAD, como AutoCAD, e é então enviado para uma empresa de fora para produzir uma fotomáscara. Fotolitografia para produzir modelo mestre. Lâminas de vidro são padronizados com qualquer um positivo fina resistir ou um negativo de espessura resistir dependendo do tamanho da estrutura que está sendo criado. Lâminas de vidro são usados ​​para os benefícios de ser de baixo custo, mais forte do que wafers de silício e não produzir poeira tanto quando quebrado. Alternativamente, outras estruturas convenientes, tais como redes de difração pode ser usado como o padrão de mestre. O slide padrão está ligado a uma pilha de slides que não tenham sido estampados. Todas as etapas são realizadas dentro de uma capela de fluxo limpo para minimizar a poeira. Criação de moldes de mestre. Um recipiente de papel alumínio um pouco maior que a pilha de slides é criada para manter a 30 g de PDMS (polidimetilsiloxano) que é então derramado sobre a superfície photolithographically padronizada para criar um molde inicial. O PDMS é desgaseificados e permitiu a cura para 1-2 dias. Uma vez curado, o PDMS é retirado do padrão de mestre e forma um molde para a próxima etapa. 6 g de 2 epóxi parte (Devcon # 14310 (6 g) é misturado por 1 minuto e então derramada no molde mestre, desgaseificados e permitiu a cura. Desgaseificação o epóxi deve ser feito rapidamente (<8 min) usando bolha muitos quebrando ciclos e usando apenas uma fina camada antes que os conjuntos de epoxy e remoção de bolhas torna-se impossível remover as bolhas. O g 6 utilizado produz uma fina camada que facilita a remoção de bolhas rápido. Após uma hora, o epóxi parte 2 será parcialmente curado e mais epóxi podem ser adicionados no topo sem desgaseificação para produzir uma estrutura que é mais grosso easer para lidar em etapas posteriores. O epoxy é, então, autorizado a cura para 1-2 dias. Uma vez curado, o epóxi é removido do molde mestre PDMS e fita é enrolada em torno do molde de epóxi para formar um recipiente. Um molde de trabalho é então criada por vazamento PDMS no molde de epóxi, desgaseificação do PDMS, e cura de 1-2 dias. Uma vez curado, o molde de trabalho é arrancado do epoxy e armazenados para manter a limpeza. 2. Padronização de superfícies com moldes para a orientação das células Pequenas seções do molde de trabalho são cortadas e colocadas em uma placa de Petri de poliestireno. As localizações dessas seções do molde são rotulados. Um tripé é formado a partir das seções pequenas e ponderado para garantir o contato entre o molde conformal de trabalho e a superfície da placa de Petri. Boa colocação pode ser observada olhando para o fundo do prato. O conjunto é colocado dentro da câmara de plasma. Tratamento de plasma é iniciado e continuado a 150 Pa em 29,6 W (potência máxima) por 10 minutos, com ar plasma. Após o tratamento de plasma, o molde e acusação de peso são removidos. Placa de Petri é colocado sob luz UV por 10 minutos de esterilização dentro da cabine de segurança biológica e armazenado lá até semeadas com células. 3. Semeadura superfícies com células Células SH-SY5Y CRL-2266 Neuroblastoma Humano ou outros são cultivadas utilizando protocolos padrão para o tipo de célula. Confluência dos SH-SY5Y CRL-2266 células Neuroblastoma Humano é medido visualmente antes da semeadura sobre a superfície modelada. Divisão celular normal é realizada para remover as células da superfície da sua placa de Petri. As células, flutuando uma vez livre, são semeados sobre a superfície da placa de Petri padronizada depois de ser diluída para atingir a confluência desejada, quando colocado na superfície padronizada. As células são autorizados a instalar e anexar à superfície. O padrão de Petri é incubada por várias horas a vários dias enquanto as células para montar o padrão criado pelo plasma. Quando a cultura de células do neuroblastoma, o ácido retinóico (10 mM) é adicionados diariamente a fim de induzir as células a se diferenciar em um estado neurônio-like. A adição do ácido retinóico é feito no escuro. O ácido retinóico é adicionados diariamente por vários dias, após o que a diferenciação será observável. Media é substituído a cada 3-4 dias. 4. Observação e Análise Imagens periódica das células vivas ou vídeos são tomadas a fim de observar o comportamento das células ao longo do tempo. Para imagens ao vivo, as células são colocadas em uma incubadora microscópio estágio superior que mantém as células a 37 ° C, umidade de 100%, e 5% CO 2. As células podem também ser fixados e corados para observação sob fluorescência <li> As imagens ou vídeos das células que foram capturados são importados para um sistema de análise de imagem e as medições são realizadas, incluindo taxa de crescimento, tamanho da célula, a velocidade de migração, diferenciação, o alinhamento, a localização de proteínas específicas, e outros. 5. Resultados representativos: Um resultado típico da aplicação da técnica de litografia de plasma é a formação de um padrão de células que se assemelha a uma estrutura arbitrária ou natural. Isto é visto na Figura 1a-b onde as linhas e redes de neurônios foram criados. Outros tipos de células podem ser usadas, assim como visto na Figura 1c-d, o que mostra células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e C2C12 células do músculo esquelético formando grades. Materiais, tais como poli-l-lisina também pode ser modelado, Figura 1e para facilitar a fixação de certos tipos celulares e para outros usos. No caso dos neurônios mostrado, o que foi criado são redes de células que possuem conexões entre eles. Esta replica o que ocorre naturalmente no cérebro onde os neurônios têm ligações discretas entre células vizinhas que influencia o funcionamento do cérebro. Com a criação de uma estrutura deste tipo no laboratório, o número, posição, freqüência e outros fatores das ligações podem ser sistematicamente controlados. O resultado dessas arraignments pode ser medida visualmente e insumos adicionais, tais como produtos químicos ou estimulação elétrica pode ser implementada para investigar o comportamento da rede. Um resultado negativo seria um padrão overgrown ou incompletos uma amostra contaminada. Um padrão incompleto ou overgrown resultaria de semeadura o substrato ou com células muito poucos ou muitos que não iria fornecer o padrão com uma quantidade ideal de células. Além disso, se o padrão não foi projetada corretamente (por exemplo, linhas muito estreito) as células não será capaz de unir e crescer com sucesso nele. No caso de uma amostra contaminada, limpeza adequada não teria sido mantida durante uma das etapas que isso é raro quando na sequência de protocolo de cultura celular adequada devido ao fato de que a padronização plasma também esteriliza o substrato. Figura 1. Padronização de células e proteínas.