細胞ネットワークの作成のためのプラズマのリソグラフィ表面パターニング

1。パターニングに使用される金型の作成パターンの概念設計。パターンは、コントロール細胞接触を細胞のネットワークを形成する細胞を単離、自然な構造を模倣、またはその他の細胞接着及び配置を導くために用意されて作成されます。 フォトマスクのパターンと創造のコンピュータ支援設計またはCADベースの作成。所望のパターンは、AutoCADなどのCADソフトウェアで設計されているし、フォトマスクを製造するために外部の会社に送信されます。 マスターパターンを生成するためにフォトリソグラフィー。ガラススライドのいずれかに抵抗薄い正または作成される構造体のサイズに応じて、レジスト厚さの負でパターン化されています。ガラスのスライドは、低コストであることの彼らの利益のために使用されるシリコンウェーハよりも強いと壊れたときに限り埃を生産されていません。また、このような回折格子のような他の便利な構造は、マスターのパターンとして使用することができます。 パターン化されたスライドは、パターン化されていないスライドのスタックに付加されます。すべてのステップは、粉塵を最小限に抑えるためにクリーンな流フード内で実行されます。 マスター金型の作成。スライドのスタックよりも少し大きいアルミホイルの容器は、初期の金型を作成するためにフォトリソグラフィによりパターン化表面の上に注がれているポリジメチルシロキサンを30g（PDMS）を保持するために作成されます。 PDMSを脱気し、1〜2日間硬化させています。 一度硬化PDMSは、マスターパターンから剥離し、次のステップのための金型を形成する。 6 2部のエポキシ（gのDevConの＃14310（6 g）を1分間混合し、マスター金型に流し込み、脱気し、硬化させている。エポキシ樹脂を脱気は、多くの気泡破壊のサイクルを使用して（<8分）をすばやく行う必要がありますとその前にのみ薄層を用いたエポキシセットと気泡除去は、気泡を除去することは不可能になります。使用さ6グラムは、迅速な気泡除去を容易に薄層を生成する。 一時間後に、2つの部分のエポキシは、部分的に硬化され、より多くのエポキシは後半の手順で処理するeaserである厚い構造を生成するために脱ガスすることなく上に追加することができます。エポキシは、その後1〜2日間硬化させています。 一度硬化、エポキシは、PDMSのマスターモールドとテープが容器を形成するエポキシモールドの周りにラップされてから削除されます。作業金型は、その後、エポキシモールドの上にPDMSを流し込みPDMSを脱気し、1〜2日間硬化させることによって作成されます。 一度硬化、作業金型は、エポキシ樹脂から剥離し、清浄度を維持するために格納されています。 2。セルの指導のための金型表面のパターニング作業金型の小さなセクションを切り出し、ポリスチレンペトリ皿の上に配置されます。これらの型のセクションの位置が表示されています。 三脚は、小さなセクションから形成され、作業をカビやペトリ皿の表面との間のコンフォーマル接触を確実にするために重み付けされます。良い配置は、皿の底を見ることで観察することができます。 アセンブリは、プラズマチャンバ内に配置されます。プラズマ処理は、空気プラズマを用いて10分間29.6 W（最大電力）で150 Paに開始し、継続しています。 プラズマ処理した後、金型と体重の罪状認否が削除されます。 ペトリ皿は、バイオセーフティキャビネット内の殺菌の10分間UV光下に置き、細胞を接種するまでそこに格納されています。 3。細胞と表面のシーディング SH – SY5Y CRL – 2266ヒト神経芽細胞腫または他の細胞は、細胞型のための標準プロトコルを用いて培養されています。 SH – SY5Yの合流点は、CRL – 2266ヒト神経芽細胞腫細胞はパターン化された表面に播種する前に視覚的に測定されます。 標準のセル分割は、それらのペトリ皿の表面から細胞を除去するために行われる。 細胞、一度フリーフロートは、パターン化表面に置かれたときに所望の合流点を達成するために希釈された後、パターニングされたペトリ皿の表面に播種されています。 細胞が定着し、表面への接続を許可されています。 細胞がプラズマによって作成されたパターンに組み立てながら、パターニングされたペトリ皿は、数日間に数時間インキュベートする。 培養神経芽細胞、レチノイン酸（10μM）は、ニューロンのような状態に分化する細胞を誘導するために毎日追加されている場合。レチノイン酸の添加は、暗闇の中で行われます。 レチノイン酸は、分化が観察されるまで、数日間毎日追加されている。 メディアは、3〜4日ごとに置換されます。 4。観測と解析生細胞またはビデオの定期的な画像が時間をかけて細胞の挙動を観察するために取られる。ライブ画像の場合、細胞は37細胞を保持する顕微鏡ステージトップインキュベーター° C、湿度100％、および5％CO 2で配置されます。細胞はまた、蛍光下で観察するために固定して染色することができます<l私捕捉された細胞の>画像や動画を画像解析システム、測定ごとにインポートされるは、成長率、セルサイズ、移動速度、分化、整列、特定のタンパク質の位置、およびその他を含む実施されています。 5。代表的な結果： プラズマのリソグラフィ技術を実装するの典型的な結果は、いくつかの任意のまたは自然な構造に似た細胞のパターンの形成である。これは、ニューロンのラインとのネットワークが作成されている図1A – Bに見られる。だけでなく、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）とグリッドを形成するC2C12骨格筋細胞を示す図1c – dは 、に見られるような他の細胞型を使用することができます。ポリ- L -リジンのような材料も、特定の細胞型のや他の用途に添付ファイルを容易にするために、 図1eをパターン化することができます。示すように、ニューロンの場合には、どのように作成されたことは、それらの間の接続を持っている細胞のネットワークです。これは、神経細胞が脳の動作に影響を与える隣接セル間の離散の接続を持っている脳の中で自然発生するものが複製されます。ラボのような構造の作成と、接続の数、位置、周波数やその他の要因は系統的に制御することができます。これらarraignmentsの結果が視覚的に測定することができ、そのような化学的又は電気的刺激などの追加入力は、ネットワークの挙動を調べるために実装することができます。 否定的な結果が生い茂ったまたは不完全なパターンや汚染されたサンプルとなります。不完全または草に覆われたパターンは、細胞の理想的な量のパターンを供給しないというどちらか少なすぎるか多すぎる細胞と基質を播種したために発生します。パターンが正しく設計されていない場合、また、（例えば、線狭すぎる）細胞が添付してそれで正常に成長することができなくなります。プラズマのパターニングにも基板を殺菌しているという事実のために適切な細胞培養のプロトコルに従う場合、これはまれですが汚染されたサンプルの場合には、適切な清浄度は、手順のいずれかの間に維持されなかったであろう。 図1。細胞と蛋白質のパターニング。