Plasma Lithografie Surface Patterning voor de schepping van Cell Networks
Summary
Een veelzijdige plasma lithografie techniek is ontwikkeld om stabiel oppervlak patronen te genereren voor de begeleiding van cellulaire bevestiging. Deze techniek kan toegepast worden op mobiele netwerken, inclusief degenen die natuurlijke weefsels na te bootsen en is gebruikt voor het bestuderen van meerdere, verschillende celtypes te creëren.
Abstract
Systematische manipulatie van een cel micro-omgeving met micro-en nanoschaal resolutie is vaak nodig voor het ontcijferen van de verschillende cellulaire en moleculaire fenomenen. Om aan deze eis, hebben we een plasma lithografie techniek om de cellulaire micro-omgeving te manipuleren door het creëren van een patroon oppervlak met functie maten variërend van 100 nm tot millimeter. Het doel van deze techniek is om te kunnen studeren, op een gecontroleerde manier, het gedrag van individuele cellen als groepen van cellen en hun interacties.
Deze plasma lithografie methode is gebaseerd op de selectieve wijziging van de oppervlakte chemie op een substraat door middel van het afschermen van het contact van een lage-temperatuur plasma met een lichamelijke mal. Deze selectieve afscherming laat een chemische patroon dat celhechting en beweging kunnen begeleiden. Dit patroon, of het oppervlak sjabloon, kan vervolgens worden gebruikt om de netwerken van cellen waarvan de structuur kan nabootsen, dat in de natuur gevonden en produceert een controleerbare omgeving voor experimenteel onderzoek te creëren. De techniek is zeer geschikt voor het bestuderen van biologisch fenomeen als het produceert stabiel oppervlak patronen op transparante polymere substraten in een biocompatibele manier. Het oppervlak patronen duurt weken tot maanden en kan zo leiden interactie met de cellen voor lange perioden waarin de studie van de lange termijn cellulaire processen, zoals differentiatie en aanpassing mogelijk maakt. De wijziging van het oppervlak is vooral chemische stof in de natuur en dus doet topografische of fysieke storing niet te voeren voor de interpretatie van de resultaten. Het maakt ook niet tot een agressieve of giftige stoffen om patronen te bereiken en geschikt is voor de weefselkweek. Bovendien kan het worden toegepast op verschillende soorten van polymère substraten, die als gevolg van de mogelijkheid om hun eigendommen af te stemmen zijn ideaal voor en worden veel gebruikt in biologische toepassingen te wijzigen. De resolutie haalbaar is ook goed, als isolatie van specifieke processen, zoals migratie, adhesie, of bindend zorgt voor discrete, heldere waarnemingen aan het single multi-niveau.
Deze methode is gebruikt om diverse netwerken van de verschillende celtypen vormen voor het onderzoek met betrekking tot migratie, signalering, weefsel en de vorming van het gedrag en de interacties van neuronen aangeklaagd in een netwerk.
Protocol
Discussion
De cel onderzoeksmethode hier gepresenteerde kunnen maken van complexe patronen van meercellig netwerken die biologische structuren na te bootsen en biedt een methode om prikkels die zijn subcellulaire in de natuur die dan vergemakkelijkt onderzoek van zowel gegroepeerd cel gedrag en single cell reacties op omgevingsfactoren te produceren. Het gebruik van deze methode is eenvoudig maar toch robuust als het kan snel worden uitgevoerd met lage kosten apparatuur in hetzelfde lab als de cel cultuur. Het is ook sterk cel gevoelig, maakt een eenvoudige observatie van de resulterende gedrag en is van nature stabiel lange perioden, waarin onderzoek naar de lange termijn cel gedrag mogelijk maakt. Het staat bovendien voor een breed scala aan experimenten uit te voeren zoals het is compatibel met vele soorten cellen en kan creëren willekeurige patronen. De lange termijn stabiliteit van de techniek is afgeleid van het feit dat het oppervlak functionalisering bijgebracht door de plasma is een deel van het oppervlak en is geen coating of een andere laag die kan worden verwijderd of afgebroken. Indien bewaard onder vloeistof, kan dit type van wijziging behoudt zijn cel leiden mogelijkheid voor maand.
Het meest kritische deel van het experiment noodzakelijk om zinvolle resultaten te waarborgen is dat het creëren van de master-patroon die uiteindelijk gebruikt zal worden voor mobiele begeleiding. Als dit patroon niet goed is ontworpen, zal cellen niet goed reageren op de patroon en kan mogelijk niet zinvol gedrag. Parameters, zoals de lijndikte, patroon afstand, en anderen kunnen grote invloed op de cel compatibiliteit met een bepaald patroon, en meestal een reeks van dergelijke parameters kunnen worden gemaakt op het eerste fotomasker om te screenen voor het meest geschikte ontwerp.
Andere belangrijke parameters met betrekking tot het uitvoeren van patronen zijn schimmel creatie, het onderhouden van een stofvrije omgeving, cel seeding en algemene steriliteit van celkweek. Mold creatie kan worden uitgevoerd door de verschillende stappen die overschrijving worden ondernomen om te zorgen voor herhaalde PDMS afkanten een epoxy mal. De epoxy mal is gemaakt, omdat het niet zal worden afgebroken in de dezelfde manier als een mal verzetten met kleine, high aspect ratio structuren onder herhaalde gieten. Indien de overdracht spuitgieten is dit juist gebeurt, zal de afmetingen en de opbrengst niet worden aangetast maar als het verkeerd gedaan, zoals door slecht ontgassen, onvolledige genezen, of overmatige verhitting, bubbels, ruwheid en vervorming van een patroon kan optreden, die invloed op het uiteindelijke resultaat. Met betrekking tot het behoud van een stofvrije omgeving, moet de mallen worden gehouden zo schoon mogelijk als elke stof kunnen interfereren met de juiste contact tussen de werkende PDMS vorm en het oppervlak en daarmee een goede plasma afscherming en chemische patronen. Het zaaien dichtheid van de cellen ook moet worden geoptimaliseerd om ervoor te zorgen dat noch te weinig of te veel cellen van het patroon gebied bewonen en steriliteit moet worden gehandhaafd om bacteriën en andere verontreinigingen van de cellen wordt gebruikt te voorkomen.
De techniek kan ook worden geïntegreerd met andere elementen, zoals microfluidics, micro-elektroden, en mechanische sondes. Dit zorgt voor extra prikkels om de cellen om beter te kunnen verschillende fysiologische omstandigheden repliceren tijdens het experimenteren en toekomstige werkzaamheden is gericht op het bestuderen van de effecten van deze combinaties
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Plasma Cleaner And Vacuum Chamber | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Inverted fluorescence and phase contrast microscope | Nikon | TE2000-U | |
| Microscope stage top incubator | AmScope | Model TCS-100 | Modified to include an enclosure that supplies an appropriate atmosphere |
| Polystyrene Petri dish | VWR | 25384-090 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy | Devcon | 2 ton clear epoxy #14310 | |
| Cell culture media | Various | Media follows standard formulations for cell type | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 |
References
- Junkin, M., Watson, J., Vande Geest, J. P., Wong, P. K. Template-Guided Self-Assembly of Colloidal Quantum Dots Using Plasma Lithography. Adv Mater. 21, 1247-1251 (2009).
- Junkin, M., Wong, P. K. Probing cell migration in confined environments by plasma lithography. Biomaterials. 32, 1848-1855 (2011).
- Keyes, J., Junkin, M., Cappello, J., Wu, X., Wong, P. K. Evaporation-induced assembly of biomimetic polypeptides. Appl Phys Lett. 93, 023120-023 (2008).
- Langowski, B. A., Uhrich, K. E. Microscale Plasma-Initiated Patterning (μPIP). Langmuir. 21, 10509-10514 (2005).
- Tourovskaia, A., Barber, T., Wickes, B. T., Hirdes, D., Grin, B., Castner, D. G. Micropatterns of Chemisorbed Cell Adhesion-Repellent Films Using Oxygen Plasma Etching and Elastomeric Masks. Langmuir. 19, 4754-4764 (2003).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
- Johansson, B. -. L., Larsson, A., Ocklind, A., Ohrlund, A. Characterization of Air Plasma-Treated Polymer Surfaces by ESCA and Contact Angle Measurements for Optimization of Surface Stability and Cell Growth. Journal of Applied Polymer Science. 86, 26185-26185 (2002).
- Murakami, T., Kuroda, S. -. i., Osawa, Z. Dynamics of Polymeric Solid Surfaces Treated with Oxygen Plasma: Effect of Aging Media after Plasma Treatment. Journal of Colloid and Interface Science. 202, 37-44 (1998).
- Strobel, M., Lyons, C. S., Mittal, K. L. . Plasma surface modification of polymers: Relevance to adhesion. , (1994).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Annual Review of Materials Science. 37, 550-575 (1998).
- Song, M., Uhrich, K. R. Optimal Micropattern Dimensions Enhance Neurite Outgrowth Rates, Lengths, and Orientations. Annals of Biomedical Engineering. 35, 1812-1820 (2007).
- Zhao, F., Wu, T., Lau, A., Jiang, T., Huang, Z., Wang, X. -. J. Nrf2 promotes neuronal cell differentiation. Free Radical Biology and Medicine. 47, 867-879 (2009).
- Ohl, A., Schroder, K. Plasma-induced chemical micropatterning for cell culturing applications: a brief review. Surface and Coatings Technology. 116-119, 820-830 (1999).
- van Kooten, T. G., Spijker, H. T., Busscher, H. J. Plasma-treated polystyrene surfaces: model surfaces for studying cell-biomaterial interactions. Biomaterials. 25, 1735-1747 (2004).
- Loesberg, W. A., te Riet, J., van Delft, F., Schön, P., Figdor, C. G., Speller, S. The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion. Biomaterials. 28, 3944-3951 (2007).
