Surface פלזמה ליתוגרפיה דפוסים של יצירת רשתות Cell

1. יצירת תבניות בשימוש דפוסים עיצוב קונספטואלי של דפוסי. דפוסי נוצרות המשמשים ליצירת רשתות התא, תא קשר שליטה, לבודד תאים, לחקות מבנים טבעי, או בכל דרך אחרת מדריך הידבקות התא והשמה. בעזרת מחשב או יצירת עיצוב CAD המבוססת על דפוס ויצירת photomask. התבנית הרצויה מעוצב תוכנות CAD, כגון AutoCAD, ו לאחר מכן נשלחת חברה חיצונית לייצור photomask. Photolithography לייצר דפוס מאסטר. שקופיות הזכוכית הם בדוגמת עם או חיובי דק להתנגד או שלילי עבה להתנגד תלוי בגודל המבנה נוצר. שקופיות הזכוכית משמשים היתרונות שלהם להיות בעלות נמוכה, חזקה יותר פרוסות סיליקון לייצור אבק ולא פחות כאשר שבור. לחלופין, מבנים נוח אחרים כגון gratings עקיפה יכול לשמש תבנית האב. השקופית בדוגמת מחובר ערימה של שקופיות אשר לא היו בדוגמת. כל הצעדים נעשים בתוך ברדס תזרים נקי כדי למזער את האבק. יצירת תבניות מאסטר. מיכל של נייר כסף מעט גדול יותר ערימה של שקופיות נוצר להחזיק 30 גרם של polydimethylsiloxane (PDMS) הנשפך אז על פני השטח בדוגמת photolithographically ליצור עובש הראשונית. PDMS היא degassed ואיפשר לרפא עבור 1-2 ימים. נרפא לאחר PDMS הוא קילף של דפוס מאסטר ויוצר עובש לשלב הבא. 6 גרם של אפוקסי חלק 2 (devcon # 14310 (6 גרם) מעורבב דקה 1 ולאחר מכן שפכו לתוך תבנית האב, degassed ואיפשר לרפא. Degassing אפוקסי חייב להיעשות מהר (<8 דקות) באמצעות בועות רבות שבירת מחזורי ושימוש רק שכבה דקה לפני שהוא קובע אפוקסי הסרת בועה בלתי אפשרי להוציא את בועות. ז 6 השתמשו מייצרת שכבה דקה המאפשרת הסרה מהירה בועה. לאחר שעה, אפוקסי 2 חלק יירפאו באופן חלקי אפוקסי יותר ניתן להוסיף על גבי ללא degassing לייצר מבנה עבה אשר easer לטפל בצעדים מאוחר יותר. אפוקסי מותר אז תרופה 1-2 ימים. נרפא פעם, אפוקסי נמחקת עובש האב PDMS קלטת כרוך סביב העובש אפוקסי להקים מיכל. עובש עובד אז נוצר על ידי שפיכת PDMS על התבנית אפוקסי, degassing PDMS, וריפוי במשך 1-2 ימים. נרפא פעם, עובש העבודה הוא קילף של אפוקסי ומאוחסנים לשמור על הניקיון. 2. דפוסים של משטחים עם תבניות להדרכה תא חלקים קטנים של עובש העבודה נחתכות החוצה והניח על צלחת פטרי קלקר. המיקומים של סעיפים אלה עובש מסומנים. חצובה נוצר מתוך בסעיפים קטנים משוקלל כדי להבטיח קשר בין עובש קונפורמי העבודה ואת משטח צלחת פטרי. מיקום טוב ניתן לראות על ידי התבוננות בחלק התחתון של המנה. הרכבה ממוקם לתא פלזמה. טיפול פלזמה היא יזמה והמשיך בבית אבא 150 ב 29.6 W (מקסימום כוח) במשך 10 דקות באמצעות אוויר פלזמה. לאחר הטיפול פלזמה, עובש לבין הגשת כתב האישום משקל יוסרו. צלחת פטרי היא תחת אור UV למשך 10 דקות של עיקור בתוך ארון biosafety ומאוחסנים שם עד seeded עם תאים. 3. מתזמן משטחים עם תאים תאים SH-SY5Y CRL-2266 Neuroblastoma אדם או אחרים תרבותי באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים עבור סוג תא. מפגש של SH-SY5Y CRL-2266 תאים Neuroblastoma האדם נמדד חזותית לפני זריעה על פני השטח בדוגמת. פיצול תא רגיל מתבצעת כדי להסיר את התאים מפני השטח של צלחת פטרי שלהם. התאים, צף ללא תשלום פעם אחת, הם זורעים על פני השטח של צלחת פטרי בדוגמת לאחר דילול כדי להשיג את המפגש הרצוי כאשר הוא ממוקם על פני השטח בדוגמת. התאים מותר להתיישב ולצרף אל פני השטח. צלחת פטרי היא בדוגמת מודגרות למשך מספר שעות עד מספר ימים תוך התאים להרכיב על גבי התבנית נוצרה על ידי הפלזמה. כאשר נוירובלסטומה culturing התאים, החומצה הרטינואית (10 מיקרומטר) מתווסף מדי יום על מנת לגרום לתאים להתמיין המדינה נוירון דמוי. תוספת של חומצה רטינואית נעשית בחושך. החומצה הרטינואית מתווסף מדי יום במשך כמה ימים, שלאחריו הבידול יהיה הנצפה. מדיה מוחלף מדי 3-4 ימים. 4. תצפית וניתוח תמונות תקופתיים של תאים חיים או קטעי וידאו נלקחים על מנת לבחון את התנהגות התא לאורך זמן. לקבלת תמונות לחיות, התאים ממוקמים שלב מיקרוסקופ חממה העליון אשר שומר את התאים ב 37 ° C, לחות 100%, 5% CO 2. תאים יכולים גם להיות קבועים מוכתם להסתכלות תחת פלואורסצנטי <li> תמונות או קטעי וידאו של תאים נתפסו מיובאים למערכת ניתוח התמונה מדידות מתבצעות כולל שיעור הצמיחה, גודל התא, מהירות הגירה, בידול, יישור, מיקום של חלבונים מסוימים, ואחרים. 5. נציג תוצאות: תוצאה אופיינית של יישום טכניקה ליתוגרפיה פלזמה היא היווצרות דפוס של תאים הדומה קצת מבנה שרירותי או טבעי. הדבר בא לידי ביטוי איור 1a-b שם שורות רשתות של נוירונים נוצרו. סוגי תאים אחרים יכולים לשמש היטב כפי שניתן לראות באיור 1c-d, המציג אדם וריד הטבור לתאי אנדותל (HUVEC) ו C2C12 לתאי שריר השלד ויוצרים רשתות. חומרים כגון פולי-L-ליזין יכול להיות גם בדוגמת, איור 1e כדי להקל על ההתקשרות של סוגי תאים מסוימים לשימושים אחרים. במקרה של הנוירונים הראו, מה נוצר הן רשתות של תאים שבהם יש קשרים ביניהם. זה משכפל מה מתרחש באופן טבעי במוח שבו נוירונים יש קשרים דיסקרטית בין תאים שכנים, אשר משפיע על פעולת המוח. עם הקמת מבנה כזה במעבדה, מספר, מיקום, תדירות וגורמים אחרים של קשרים ניתן לשלוט באופן שיטתי. התוצאה של הקראות אלו ניתן למדוד חזותית תשומות נוספות כגון כימיים או גירוי חשמלי יכול להיות מיושם כדי לחקור את התנהגות הרשת. תוצאה שלילית יהיה דפוס מגודל או חלקי או מדגם מזוהמים. דפוס שלם או מגודל היה תוצאה של זריעת את המצע עם תאים או מעט מדי או יותר מדי שלא תספק את התבנית עם כמות אידיאלי של תאים. בנוסף, אם הדפוס לא נועד נכונה (למשל, קווים צרים מדי) התאים לא יוכלו לצרף ולגדול בהצלחה על זה. במקרה של מדגם מזוהמים, ניקיון נאותה לא היה נשמר במהלך אחד השלבים אם כי זה נדיר כאשר הבאים לתא הנכון תרבות פרוטוקול בשל העובדה כי דפוסים פלזמה גם sterilizes את המצע. באיור 1. דפוסים של תאים וחלבונים.