Organotipik Kollajen Ben Assay: 3-Boyutlu Bağlamında Hücre Davranışı değerlendirin A Dövülebilir Platformu
Summary
Bir yöntem olup kollajen tip I ve primer insan fibroblast oluşan bir 3-boyutlu matrisi hazırlanması için tarif edilmektedir. Bu doku stroma temel özelliklerini taklit eder ve mikroskopi birçok formları için müsait olduğundan bu organotipik jel invaziv hücre göçü değerlendirmek için yararlı bir substrat olarak hizmet vermektedir.
Abstract
Hücre göçü gelişimi, yara iyileşmesi, bağışıklık sisteminin hücresel yanıtları, ve tümör hücrelerinin metastaz gibi biyolojinin birçok yönleri için esastır. Göç ışık mikroskobu ile incelenmesi için mükellef hücresel dinamikleri yapmak için cam lameller üzerine çalışılmıştır. Ancak, hücre göçü birçok açıdan sadakatle cam ve plastik 1 gibi sert iki boyutlu yüzeyler tarafından temsil edilmeyen, elastikiyet, protein kompozisyonu ve gözenek boyutu dahil yerel çevrenin özelliklerine bağlı olduğu açık hale gelmiştir. Ayrıca, stromal fibroblastlann 2 ve 3 bağışıklık hücreleri dahil olmak üzere diğer hücre tipleri ile etkileşimi kanser hücreleri istila teşvik edilmesinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Moleküler düzeyde incelenmesi giderek karşılaştırıldığında aynı hücrelerin ilaç tedavisine yanıt dahil moleküler dinamik, önemli ölçüde farklı olduğunu göstermiştir <em> In vitro ve in vivo 4.
İdeal olarak, bu canlılar kendi doğal bağlamında hücre göçü incelemek için iyi olurdu, ancak bu her zaman mümkün değildir. Böyle hücre elde matrisi, Matrigel, organotipik kültürü (burada açıklanan) doku eksplant, organoids ve xenografts gibi Orta doku kültürü sistemleri, bu nedenle önemli deneysel ara vardır. Bu sistemler yaklaşık bazı in vivo ortamda yönlerini ancak böyle stably transfekte hücre hatları, ilaç tedavisi rejimleri, uzun vadeli ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme kullanımı gibi deneysel manipülasyon için daha uygundurlar. Böyle ara sistemleri probları doğrulamak ve görüntü öncesinde vivo 5 görüntüleme üstlenen hücreleri ve floresan gazetecilere dinamik tepki için gerekli parametreleri kurmak Vaitoudden olarak özellikle yararlıdır. Bu nedenle, onlar livin üzerinde deney ihtiyacını azaltmada önemli bir rol hizmet edebilirg hayvanlar.
Protocol
Discussion
Burada invaziv hücre göçü 6-8 çalışmalar için uygun bir 3-boyutlu matrisi üretmek için bir yöntem sunmaktır. Matris birincil insan epidermal fibroblastlar tarafından birkaç gün bir süre içinde sözleşmeli kollajen tip 1 fibrillerinin oluşmaktadır. Kollajen poli-peptit ucunda tepkime özelliklerini koruyan ve tampon koşulları 9 nötrleştirme üzerine daha büyük agregalar halinde kollajen fibrillerin çapraz bağlanma teşvik asit ekstraksiyon, değil enzimatik sindirimi ile hazırlanır. Daha yakından in vivo kolajen özelliklerini taklit eder ve jel içinde kültür hücrelerinin invazif özellikleri için önemli sonuçlara sahiptir yeniden oluşturulmuş jel elde edilir. Kollajen çapraz bağlama genç hayvanlarda daha kararsızdır çünkü taze veya dondurulmuş başlangıç malzemesi kullanılıp kullanılmadığını önemli, ama ergen sıçan kuyrukları kullanmak değildir önemlidir. Kollajen Ben genç hayvanlardan elde etmek bu nedenle kolay ve w yeniden oluştururITH yüksek sadakat.
Kolajen matris sabittir ve lekeli istilacı tümör hücreleri ya da stromal fibroblastlann 2,10 ya karşı yönlendirilmiş antikorlar ile ve istila 5,6 inhibe ilaçların etkinliğini test etmek için son derece yararlıdır edilebilir.
Bu protokol, birincil insan derisi fibroblast kullanımını göstermektedir, ancak, bu araştırma altında doku tipine bağlı olarak, diğer doku tipi, ikinci birincil fibroblast kullanmak mümkündür. Bu stabil bir şekilde floresan protein konjugatları ile transfekte edilmiş olan hücreler de dahil olmak üzere ölümsüzleştirilmiş, fibroblastlar, kültürleri kullanılarak oluşturulması da mümkündür. Bu şekilde stromal tümör her iki hücre invazyonu 11 sırasında hücre-hücre etkileşimleri görselleştirmek için etiketlenmiş olabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 10x MEM | Gibco | 21430 | – |
| NaOH | Sigma | 367176-500G | Prepare 0.22 M stock in water |
| FCS | PAA Laboratories | A15-101 | – |
| 35 mm dishes | Falcon | 353001 | For step 3.4 |
| 60 mm dishes | Falcon | 353004 | For step 5.2 |
| Spring forceps blunt | Samco | E003/02 | Toothed, not smooth |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | Dilute to 4% in PBS prior to use |
| Screens for cd-1, size 40 mesh | Sigma | S07707-5EA | Stainless steel grids, 5 per pack |
| Dialysis tubing | Medicell International | 7607 2295 | 12 – 14 kD |
| PBS | Oxoid | BR0014G | – |
| Acetic Acid | Sigma | 242853 | – |
| 24 well dish | Falcon | 353047 | For step 4.1 |
| Fungizone | In vitrogen | 15290018 | – |
References
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Edward, M., Gillan, C., Micha, D., Tammi, R. H. Tumour regulation of fibroblast hyaluronan expression: a mechanism to facilitate tumour growth and invasion. Carcinogenesis. 26, 1215-1223 (2005).
- Patsialou, A. Invasion of human breast cancer cells in vivo requires both paracrine and autocrine loops involving the colony-stimulating factor-1 receptor. Cancer Res. 69, 9498-9506 (2009).
- Serrels, A. Real-time study of E-cadherin and membrane dynamics in living animals: implications for disease modeling and drug development. Cancer Res. 69, 2714-2719 (2009).
- Timpson, P. Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53. Cancer Res. 71, 747-757 (2011).
- Edward, M., Quinn, J. A., Pasonen-Seppanen, S. M., McCann, B. A., Tammi, R. H. 4-Methylumbelliferone inhibits tumour cell growth and the activation of stromal hyaluronan synthesis by melanoma cell-derived factors. Br. J. Dermatol. 162, 1224-1232 (2010).
- Fusenig, N. E. Growth and differentiation characteristics of transformed keratinocytes from mouse and human skin in vitro and in vivo. J. Invest. Dermatol. 81, 168s-175s (1983).
- Nystrom, M. L. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J. Pathol. 205, 468-475 (2005).
- Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited. J. Cell. Biol. 185, 11-19 (2009).
- Amjad, S. B., Carachi, R., Edward, M. Keratinocyte regulation of TGF-beta and connective tissue growth factor expression: a role in suppression of scar tissue formation. Wound Repair Regen. 15, 748-755 (2007).
- Gaggioli, C. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nat. Cell. Biol. 9, 1392-1400 (2007).
