عضوي النمط I الكولاجين الفحص: A منهاج طيع لتقييم سلوك الخلية في سياق الأبعاد 3-
Summary
يوصف أسلوب لإعداد مصفوفة الأبعاد 3-تتكون من نوع الكولاجين الأول والخلايا الليفية الإنسان الأساسية. هذا جل عضوي النمط بمثابة الركيزة مفيدة لتقييم الغازية الهجرة الخلية لأنه يحاكي السمات الأساسية للأنسجة سدى، وهي قابلة للكثير من أشكال المجهري.
Abstract
الهجرة الخلية الأساسية لكثير من جوانب علم الأحياء، بما في ذلك الشفاء التنمية الجرح، والاستجابات الخلوية في الجهاز المناعي، وورم خبيث من خلايا الورم. وقد درس الهجرة على coverslips الزجاج من أجل جعل ديناميات الخلوية قابلة للتحقيق من قبل المجهر الضوئي. ومع ذلك، فقد أصبح من الواضح أن العديد من جوانب الهجرة الخلية تعتمد على ملامح البيئة المحلية بما في ذلك مرونته، وتكوين البروتين، وحجم المسام، والتي لا تمثل بأمانة من ركائز صلبة 2 الأبعاد مثل الزجاج والبلاستيك 1. وعلاوة على ذلك، فقد تبين التفاعل مع أنواع الخلايا الأخرى، بما في ذلك الخلايا الليفية اللحمية (2) والخلايا المناعية 3، لتلعب دورا حاسما في تعزيز غزو الخلايا السرطانية. وقد أظهرت التحقيقات على المستوى الجزيئي على نحو متزايد أن ديناميات الجزيئية، بما في ذلك الاستجابة للعلاج المخدرات، من الخلايا متطابقة تختلف اختلافا كبيرا بالمقارنة <em> في التجارب المختبرية والحية 4.
من الناحية المثالية، فإنه سيكون من الأفضل لدراسة الهجرة الخلية في سياقها التي تحدث بشكل طبيعي في الكائنات الحية، ولكن هذا ليس من الممكن دائما. نظم زراعة الأنسجة وسيطة، مثل مصفوفة الخلايا المشتقة، matrigel والثقافة عضوي النمط (الموصوفة هنا) إإكسبلنتس الأنسجة، organoids، والأعضاء المستمدة من الحيوانات، ولذلك فإن وسيطة التجريبية الهامة. هذه الأنظمة بعض جوانب التقريبي لفي الجسم الحي ولكن البيئة هي أكثر قابلية للتلاعب التجريبية مثل استخدام خطوط الخلايا ثابت بالنقل، ونظم العلاج من تعاطي المخدرات، على المدى الطويل والتصوير عالية الدقة. نظم وسيطة مثل هذه مفيدة خاصة أن تثبت الأسباب للتحقق من صحة تحقيقات ووضع معايير المطلوبة لصورة الاستجابة الديناميكية للخلايا وصحفيين الفلورسنت قبل إجراء التصوير في الجسم الحي 5. على هذا النحو، فإنها يمكن أن تؤدي دورا هاما في الحد من الحاجة لإجراء تجارب على يفينز الحيوانات.
Protocol
Discussion
هنا نقدم طريقة لإنتاج مصفوفة الأبعاد 3-مناسبة لدراسات الهجرة الخلية الغازية 6-8. المصفوفة يتكون من الألياف الكولاجين من النوع 1، والتي يتم التعاقد على مدى فترة من عدة أيام من الخلايا الليفية الأولية البشرة الإنسان. مستعدة الكولاجين من استخلاص الحمض، وليس الهضم الأنزيمية، الذي يحافظ على تفاعل في نهايات بولي ببتيد ويعزز عبر ربط الألياف الكولاجين في أكبر المجاميع على تحييد الظروف العازلة 9. وهذا يؤدي إلى هلام إعادة تشكيلها على نحو أوثق الذي يحاكي ملامح الكولاجين في الجسم الحي ولها عواقب مهمة بالنسبة لخصائص الغازية من الخلايا المستزرعة في المواد الهلامية. لا يهم ما إذا كان يتم استخدام المواد الطازجة أو المجمدة البداية، ولكن استخدام من ذيول الفئران المراهقين أمر مهم لأن الكولاجين عبر ربط أكثر عطوب في أصغر الحيوانات. I الكولاجين من الحيوانات الأصغر وبالتالي أسهل للاستخراج، وإعادة تشكل ثإيث أعلى الإخلاص.
يمكن ان تكون ثابتة في مادة الكولاجين وملطخة الأجسام المضادة الموجهة ضد خلايا الورم إما الغازية أو الخلايا الليفية اللحمية 2،10 ومفيدة للغاية لاختبار نجاعة الأدوية التي قد تحول دون غزو 5،6.
على الرغم من أن هذا البروتوكول يشير إلى استخدام الخلايا الليفية الأولية جلد الإنسان، فمن الممكن استخدام الخلايا الليفية الأولية من أنواع الأنسجة الأخرى، وفقا لنوع الأنسجة قيد التحقيق. ومن الممكن أيضا لإنشاء الثقافات باستخدام الخلايا الليفية خلد، بما في ذلك الخلايا التي تم ستابلي مع تقارن بروتين فلوري. وبهذه الطريقة يمكن أن توصف الخلايا اللحمية والأورام على حد سواء لتصور خلية خلية التفاعلات أثناء غزو 11.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 10x MEM | Gibco | 21430 | – |
| NaOH | Sigma | 367176-500G | Prepare 0.22 M stock in water |
| FCS | PAA Laboratories | A15-101 | – |
| 35 mm dishes | Falcon | 353001 | For step 3.4 |
| 60 mm dishes | Falcon | 353004 | For step 5.2 |
| Spring forceps blunt | Samco | E003/02 | Toothed, not smooth |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | Dilute to 4% in PBS prior to use |
| Screens for cd-1, size 40 mesh | Sigma | S07707-5EA | Stainless steel grids, 5 per pack |
| Dialysis tubing | Medicell International | 7607 2295 | 12 – 14 kD |
| PBS | Oxoid | BR0014G | – |
| Acetic Acid | Sigma | 242853 | – |
| 24 well dish | Falcon | 353047 | For step 4.1 |
| Fungizone | In vitrogen | 15290018 | – |
References
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Edward, M., Gillan, C., Micha, D., Tammi, R. H. Tumour regulation of fibroblast hyaluronan expression: a mechanism to facilitate tumour growth and invasion. Carcinogenesis. 26, 1215-1223 (2005).
- Patsialou, A. Invasion of human breast cancer cells in vivo requires both paracrine and autocrine loops involving the colony-stimulating factor-1 receptor. Cancer Res. 69, 9498-9506 (2009).
- Serrels, A. Real-time study of E-cadherin and membrane dynamics in living animals: implications for disease modeling and drug development. Cancer Res. 69, 2714-2719 (2009).
- Timpson, P. Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53. Cancer Res. 71, 747-757 (2011).
- Edward, M., Quinn, J. A., Pasonen-Seppanen, S. M., McCann, B. A., Tammi, R. H. 4-Methylumbelliferone inhibits tumour cell growth and the activation of stromal hyaluronan synthesis by melanoma cell-derived factors. Br. J. Dermatol. 162, 1224-1232 (2010).
- Fusenig, N. E. Growth and differentiation characteristics of transformed keratinocytes from mouse and human skin in vitro and in vivo. J. Invest. Dermatol. 81, 168s-175s (1983).
- Nystrom, M. L. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J. Pathol. 205, 468-475 (2005).
- Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited. J. Cell. Biol. 185, 11-19 (2009).
- Amjad, S. B., Carachi, R., Edward, M. Keratinocyte regulation of TGF-beta and connective tissue growth factor expression: a role in suppression of scar tissue formation. Wound Repair Regen. 15, 748-755 (2007).
- Gaggioli, C. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nat. Cell. Biol. 9, 1392-1400 (2007).
