Органотипической коллагена I Анализ: ковкий платформы для оценки сотовый Поведение в 3-мерной Контекст

1. Создание культуры фибробластов из кожи эксплантов 4 мм биопсии удар, приобретенные у человека предплечья находятся в MEM дополнен 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 0,25 мкг / мл Fungizone. Обрезать любой подкожного жира и мелко нарезать биопсию на мелкие кусочки по качалки № 24 лезвие скальпеля на дно чашки Петри. Место ткани пульпы в 25 см 2 культуре ткани колбу с первичными роста фибробластов средств массовой информации (MEM с добавлением 10% FCS, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 25 мкг / мл Fungizone) добавляют до поверхности колбы покрыты жидкостью, но глубина недостаточна для ткани плавать. После 3 дней инкубации при 37 ° C во влажной атмосфере 5% CO 2, добавьте 3 мл основной среды роста фибробластов. После еще 3 дня среды инкубации изменений со свежим первичным медиа роста фибробластов, или если челLs почти сливающийся они могут быть разделены 1:04 в свежей среде. (Fungizone может быть опущена с этого момента). 2. I этап – подготовка коллагена I от крысиные хвосты Примечание: Протокол примерно 12-14 подростков (свежей или замороженной) хвосты крыс Подготовка крысы хвост мытья в 70% этанола и удалить сухожилия следующим образом: Удалите кожу от хвоста крысы, нарезая в середине хвоста сверху вниз с помощью скальпеля и звон по всей длине хвоста. Отсоедините сухожилия от ядра проксимальной области хвоста. Удалить сухожилия к дистальной части хвоста избежать оболочка использованием зубчатых щипцов. Извлечение 1 г сухожилия / 250 мл 0,5 М уксусной кислоты при перемешивании при температуре 4 ° C в течение 48 часов. Центрифуга экстракт (7500 мкг) в течение 30 минут и удалить осадок. Добавить равный объем 10% (вес / объем) NaCl в супернатант, и перемешивают в течение 30-60 мин. <lI> Центрифуги (10.000 мкг) в течение 30 минут, отбросить супернатант, и вновь растворения осадка в 0,25 М уксусной кислоты при ~ соотношении 1:1 при перемешивании в течение 24 ч при 4 ° C. Диализировать коллагена решение против 6-8 изменениях 6L ~ 17,5 мм уксусной кислоты (1 мл ледяной уксусной кислоты на литр холодной воды, изменением 2 раза в день). Центрифуга диализу коллагена при 30000 х г в течение 1,5 часов. Удалите супернатант и место в стерильной колбе. Отрегулируйте коллагена I концентрации ~ 2 мг / мл с помощью 0,5 мМ уксусной кислоты при температуре 4 ° C. 3. II этап – создание 3D-матрицы со встроенными фибробластов (позволяют заключить контракт в течение 8 дней). Соберите смеси с использованием холодного реагенты при температуре 4 ° C в предварительно охлажденную бутылку. Держите коллагена I на льду. С одной колбе T75 вырожденных первичных фибробластов (~ количество клеток 1 х 10 6) использование: 25 мл крысиного хвоста коллагена (около конц 2mg/ml) 3 мл 10xMEM 0,22 М NaOH: во-первых, добавить 2 мл, затем по каплям при перемешивании, пока коллагена становится оранжевым, но не розовый (как правило, до 3 мл). Приблизительное р H = 7,2. Примечание: Важно, чтобы убедиться, что средняя / гель остается нейтральной или слабокислой как фибробласты не будут сокращаться гель при воздействии даже слегка щелочной среде. Trypsinise фибробластов, спина при 400 мкг в течение 5 минут и удалить супернатант. В течение 5 минут крутить выше: Подготовка 12 х 35 мм пластиковая посуда – как правило, достижения 12 блюд из одной колбы фибробластов / коллаген смеси. Повторное приостановить фибробластов в 3 мл ФТС и сразу же добавить к смеси коллагена и перемешать. Плита примерно 2,5 мл коллагена / фибробластов за блюдо как можно быстрее. Постарайтесь, чтобы избежать пузырей и коллагена настройки. Пусть коллагена установлен на уровне 37 ° C во влажной атмосфере 5% CO 2 в воздухе в течение 10 мин. Добавить 1 мл фибробластов растий среды (DMEM + 10% FCS). Снимите коллаген / фибробластов матрицу из сторон блюдо с помощью пипетки. Следующий день: Добавить 1 мл роста фибробластов среды (DMEM + 10% FCS). Изменение средств массовой информации каждый день. Разрешить коллаген / фибробластов матрицы контракт на приблизительно 8 дней, пока они не вписываются в 24-луночных блюдо (сокращение от ~ 3,5 см до 1,5 см в диаметре, см. Рисунок 1). Примечание: коллагеновые концентрация должна быть скорректирована в соответствии с приложением. Чем больше разбавить раствора коллагена, тем быстрее он будет заключен контракт на фибробласты. Незначительные различия в сокращении ставка будет опыт работы с различными партиями коллагена в той же концентрации. Кроме того, разные культуры фибробластов сократится коллагена гелей с различной скоростью, и чем больше фибробластов представить, тем быстрее скорость сокращения. Концентрация коллагена и фибробластов плотности, следовательно, с корректировкой на изменение скорости сокращения,и окончательная плотность коллагеновый гель. 4. II этап – покрытие клеток интерес в верхней части матрицы Примечание: Стерилизовать всех щипцов и оборудования с этанолом перед использованием. Использование тупым пинцетом, осторожно двигаться по контракту матрица 24-а блюдо. Убедитесь, что она не раз. Подготовка суспензии клеток интерес примерно 4 х 10 4 / мл и 1 мл пластины (после trypsinising, спина клетки, чтобы избавиться от трипсина) в верхней части матрицы. Фактическое количество клеток необходимо будет варьироваться в зависимости от типа клеток используются. Сотовые среде должна быть нормальной среде роста для клеток интерес. Разрешить клетки расти до слияния в верхней части матрицы, примерно 3-5 дней. 5. III этап – передача матрицы к сетке для вторжения (примерно 0-21 дней) Вырезать нержавеющими решетками для создания штатив и стерилизации перед использованием (см. Рисунок 2). Поместить стерильную сетку6 см блюдо, добавить питательной среды выше уровня сетки (примерно 10.5ml). Место матрицы на сетку и осторожно аспирации СМИ, чтобы в нижней части матрицы находится в контакте со средствами массовой информации, но не под водой. Это называется, как воздух / жидкость, которая создает градиент, что способствует вторжению. Заменить среднего каждые два дня (см. Рисунок 2). Живая клетка, контекстной визуализации с использованием флуоресцентных клеток может быть отображена на данном этапе или ранее. По контракту или фибриллярных коллагеновых я может быть отображена использованием генерации второй гармоники (SHG, см. рисунок 3). Использование многофотонного возбуждения в сочетании с широким полем обнаружения мы находим, что SHG может быть отображена не менее 100 мкм в матрицу, в то время как клетки, экспрессирующие GFP цитоплазматических может быть отображена по крайней мере, 200 мкм глубоко. Примечание: В отношении количественного вторжения, в день, на который матрицами размещены на сетках определяет День 0. Размещение на сетках создается градиент СМИ культуре клеток, что способствует вторжению Int Ø матрицы. Образцы могут быть отображены в течение ближайших 1 – 21 дней (или больше) для оценки биологических процессов, таких как вторжение, пролиферации, выживания или дифференциации (см. список литературы). 6. IV этап – фиксация Добавьте 5 мл 4% PFA в трубке Falcon. Передача матрицы на плоской поверхности. Разрежьте пополам матрицы со свежим чистым скальпелем (как вы будете окрашивания сечение), поднимите матрица с скальпеля и передачи до 4% PFA, исправить в течение ночи. Органотипической матриц готовы для окрашивания с антителами / пятно выбор (см. рисунок 3). 7. Представитель результаты: Рисунок 1 Пример фибробластов по контракту коллагена I. Смесь из фибробластов и крысы хвост коллагена отделяется от чашки Петри и позволили заключить контракт в течение 6-8 дней. Рисунок 2 "SRC =" / files/ftp_upload/3089/3089fig2.jpg "/> Рисунок 2 органотипической прогрессии анализа. , Схема органотипических настройки и прогрессии. B, пример коллаген / фибробластов матрицы на верхнем из нержавеющей стали, стерильные сетки для создания воздух / жидкость. Рисунок 3 Применение органотипических анализа. A, B неинвазивные и инвазивные аденокарциномы поджелудочной железы протоков (ККПР) клеток вторжения со временем органотипических матрицы. C, живущих кожи эквивалентной показывает стратифицированную эпидермиса на фибробласты по контракту коллагеновых кожного компонента. D, C8161 клеток меланомы вторжения в систему, чтобы фибробластов -контракт коллагеновых дермального эквивалента. Е, инвазивные PDAC клеток (зеленый) взаимодействует и вторжение с фибробластами (красный) в органотипических матрицы. F </stronг>, инвазивных клеток PDAC (зеленый) взаимодействует с унижающего достоинство окружающих внеклеточного матрикса (фиолетовый) визуализированы с помощью многофотонных на основе генерации второй гармоники.